从miRNA调控探讨草果知母汤治疗癫痫的作用机制

高嘉骏，陈志耿，林震溪

（福建中医药大学中医学院，福建 福州 350122）

草果知母汤为《温病条辨》所首载，著名内经学家王洪图根据《内经》脾胃的气机转枢理论，从调节脾胃入手，应用加减草果知母汤治疗癫痫，经过多年的临床观察和动物实验均表明草果知母汤对癫痫治疗效果明确［1-5］。为进一步探讨草果知母汤抗痫的可能作用机制，本课题复制戊四唑（PTZ）慢性诱导致痫的动物模型，观察草果知母汤对癫痫大鼠行为学、脑海马组织病理学、神经元凋亡变化、miRNA和凋亡相关基因表达等指标的影响，为草果知母汤的临床应用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠60只，体重180～220 g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，合格证号：SCXK（沪）2012-0002，饲养于福建中医药大学实验动物中心SPF级动物房，湿度（55±5）%，室温（22±2）℃，12∶12 h 光暗循环。

1.2 药物及制备 草果、知母、厚朴、半夏、黄芩、甘草等中药均购自福建省药材公司，由福建中医药大学药学院杨成梓教授鉴定。按照原处方，在蒸馏水中煮沸两次，每次煎煮1 h；然后将溶液在真空下干燥浓缩成 0.375、0.75、1.5 g／mL 生药 3 种浓度提取液，冷藏备用。

1.3 主要试剂与仪器 Bax、Bcl-2、P53抗体（英国abcam 公司）；PTZ（美国 Sigma公司）；超纯 RNA提取试剂、反转录试剂盒、Real－time PCR试剂盒、SYBR Premix Ex Taq宝生物染料法荧光定量试剂盒（日本TaKaRa公司）；Bio-Rad凝胶成像分析系统（美国Bio-Rad公司）；QL-902涡旋振荡仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；Centrifuge 5415D离心机（德国 Eppendorf公司）；NANODROP 2000分光光度计（美国 Therno scientific公司）；ABI 7500荧光定量PCR仪（美国Applied Biosystems公司）。

1.4 模型制备及给药 60只大鼠按随机数字表法分成5组：正常组，模型组，草果知母汤低、中、高剂量组。除正常组外，其余4组均参考张丽萍等癫痫模型的制备方法造模［1-5］。模型组，草果知母汤低、中、高剂量组均以PTZ亚惊厥剂量35 mg／kg腹腔注射，1次／d，持续4周。停药1周后于第5周末，再次用相同剂量PTZ进行末次点燃测试。大鼠惊厥发作依据七点评分法［6］为评判标准，凡显示连续5次以上Ⅱ级或Ⅱ级以上惊厥为达到点燃标准，Ⅳ～Ⅵ级的痫性行为被视为充分点燃。各组在造模1 h后即开始给药：正常组、模型组以双蒸水2 mL／kg灌胃，草果知母汤低、中、高剂量组分别以0.375、0.75、1.5 g／mL生药提取液 2 mL／kg灌胃， 每日 1次，持续 28 d。

1.5 取材 第5周末待所有大鼠行为学观察完成后，将各组大鼠以10%水合氯醛3 mL／kg腹腔注射麻醉，断头取脑，迅速在含有生理盐水的冰面上钝性分离出双侧海马组织。左脑海马立即进行4%多聚甲醛固定，制备海马组织石蜡标本，以5 μm厚连续切片，备HE染色及TUNEL法检测使用；右脑海马组织冻存于－80℃液氮中备PT-PCR检测及Western Blot印迹分析使用。

2 指标检测

2.1 观察草果知母汤对癫痫大鼠行为学的影响每天给药后观察各组大鼠的行为学表现2 h，癫痫发作时使用 Sanya EO等人的方法［7］进行评分，分级包括：0级，活动无变化，无响应，计0分；I级，前肢或后肢抓扒或凝视＞5 s，计1分；Ⅱ级，I级加上抬身、点头或双侧肢体抓扒，计2分；III级，跳跃、摆动或跌倒，计3分；IV级，癫痫持续状态或死亡，计4分。

2.2 HE染色后行组织病理学观察 取脑海马组织切片（5 μm）置于载玻片上，65℃ 烘烤 3～5 h，脱蜡，经苏木素-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色后，在光学显微镜（400倍）下观察组织病理学变化。

2.3 TUNEL法检测各组癫痫大鼠海马组织神经细胞凋亡情况 海马组织的脱蜡同2.2述操作。① 滴加 20 μg／mL 不含 DNase的蛋白酶 K（室温，30 min），PBS洗3次；② 3%过氧化氢溶液中室温孵育10 min，PBS洗3次；③ 加50 μL生物素标记液于切片上，37℃孵育 60 min，PBS洗 1次；④ 加 0.2 mL反应终止液，室温孵育10 min，PBS洗3次；⑤ 按说明书配Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液；⑥苏木素复染，封片；⑦ 光学显微镜（400倍）下观察，每个样本随机选取5个视野，获取图像。TUNEL法表现为棕色或深棕色细胞核染色，当细胞发生凋亡时，其表达增加。结果用多功能真彩色细胞图象分析管理系统分析，用平均灰度值进行半定量分析。以阳性细胞的百分率作为评价标准。

2.4 RT-PCR检测大鼠海马组织miR-21、miR-29和凋亡相关基因 Bax、Bcl-2、P53 mRNA表达 用超纯RNA提取试剂提取海马组织样本中 RNA，取5 μL总RNA用1%琼脂糖凝胶进行电泳；接着，用反转录试剂盒中的gDNA Eraser对RNA中残留的基因组DNA进行消化处理，继而用反转录试剂盒进行反转录；最后，使用ABI 7500型荧光定量PCR仪及SYBR Premix Ex Taq进行扩增。扩增程序为：① 预变性，95℃ 30 s；② PCR反应 40个循环，95℃5 s，60℃ 34 s；③ 解离。根据反应结果读取数值，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。引物由上海introvigen公司合成，引物序列见表1：

表1 引物序列

2.5 Western Blot法分析凋亡相关基因Bax、Bcl-2、P53蛋白表达 将分离的海马组织用含有蛋白酶抑制剂混合物（PMSF）的RIPA裂解缓冲液在冰上裂解，然后将它们置高速离心机中，4℃，12 000 rmp离心15 min；收集裂解物，并通过BCA法测定蛋白质浓度；蛋白质在12%密度SDS丙烯酰胺凝胶上电泳，使用电转移系统从凝胶转移到PVDF膜上，采用 P53 抗体（1∶1 000）、P-BAD（1∶500）、Bax（1∶1 000）、裂解 PARP（1∶1 000）、Bcl xL（1∶1 000）、Bcl-2（1∶1 000）和 β-肌动蛋白（1∶10）于 4℃中孵育过夜，用第二抗体（1∶7 000）在室温下孵育 2 h；最后，使用Image Lab分析软件上的ECL Western检测试剂对它们进行评估，使用β-肌动蛋白作为内参。

2.6 统计学方法 实验数据采用SPSS 20.0统计软件进行处理分析。计量资料属正态分布以（x±s）表示，多组数据比较使用单因素方差分析，两组数据比较采用t检验。

3 结 果

3.1 草果知母汤对癫痫大鼠行为学的影响 如表2所示，正常组大鼠未观察到惊厥，但模型组大鼠与正常组相比表现出严重的惊厥。草果知母汤中、高剂量组显示出明显的抗惊厥作用（p＜0.05或0.01）。

表2 各组大鼠不同时相惊厥等级评分比较分

表2 各组大鼠不同时相惊厥等级评分比较分

注：与模型组比较，1） p＜0.05，2） p＜0.01。

组别正常组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n88888第1周00000第2周0 1.91±0.65 1.86±0.61 1.32±0.241）1.28±0.351）第3周0 2.96±0.58 2.22±0.51 1.96±0.421）1.82±0.532）第4周0 4.11±0.63 3.98±0.59 2.24±0.561）2.01±0.562）第5周0 5.34±0.76 5.10±0.62 2.45±0.532）2.11±0.612）

3.2 草果知母汤对癫痫大鼠海马区组织病理学的影响 正常组海马细胞排列整齐，细胞形态正常，结构清晰可见，细胞膜、细胞核和组织间隙均正常（见图1）；模型组海马细胞排列紊乱，核仁皱缩，核仁断裂，胞浆离散，空泡样变性；草果知母汤中、高剂量组神经元形态未见明显异常。

图1 草果知母汤对癫痫大鼠海马区组织病理学的影响（×400）

3.3 草果知母汤对癫痫大鼠海马组织神经细胞凋亡的影响 TUNEL染色法结果显示：与正常组比较，模型组凋亡细胞数明显增加，具有非常显著差异（p＜0.01）；与模型组比较，草果知母汤中、高剂量组凋亡细胞数明显减少，具有非常显著性差异（p＜0.01）。 见图 2。

图2 TUNEL染色法结果（×400）

3.4 草果知母汤对癫痫大鼠海马组织miR-21、miR-29和 Bax、Bcl-2、P53 mRNA表达的影响 见表3。

表3 草果知母汤对癫痫大鼠海马组织miR-21、miR-29和Bax、Bcl-2、P53 mRNA表达的影响

表3 草果知母汤对癫痫大鼠海马组织miR-21、miR-29和Bax、Bcl-2、P53 mRNA表达的影响

注：与正常组比较，1） p＜0.05，2） p＜0.01；与模型组比较，3） p＜0.05，4） p＜0.01。

组别正常组模型组低剂量组中剂量组高剂量组n88888 miR-21 2.103±0.35 0.851±0.05 0.902±0.552）1.364±0.631）3）1.989±0.864）miR-29 1.23±0.24 2.03±0.162）1.90±0.362）1.56±0.161）3）1.485±0.914）Bax 1.18±0.02 1.88±0.022）1.72±0.042）1.51±0.011）3）1.46±0.364）Bcl-2 1.15±0.02 0.53±0.0122）0.65±0.0332）0.96±0.0561）3）1.11±0.0714）P53 1.27±0.26 3.14±0.872）2.53±0.122）2.10±0.481）3）1.95±0.774）

3.5 草果知母汤对癫痫大鼠海马组织 Bax、Bcl-2、P53蛋白表达的影响 草果知母汤对癫痫大鼠海马组织 Bax、Bcl-2、P53蛋白表达的影响见图3。结果表明：与正常组比较，模型组的 Bax、P53蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达减少，差异具有非常显著性（p＜0.01）。与模型组比较，草果知母汤低、中、高剂量 Bax、P53蛋白表达有不同程度降低（p＜0.01），Bcl-2蛋白表达增加（p＜0.01）。

4 讨 论

已有药理研究表明：草果知母汤具有良好的抗癫痫作用，可显著改善癫痫行为，改善脑组织学变化，减少 GABA和 GABAAR mRNA的表达［2-5］。本课题重复使用亚惊厥剂量的PTZ，成功复制目前公认的大鼠癫痫实验模型［12-13］。草果知母汤的给药可明显减轻PTZ点燃大鼠癫痫发作的严重程度，再次验证了其对癫痫的治疗作用。

图3 草果知母汤对癫痫大鼠Bax、Bcl-2、P53蛋白表达的影响

癫痫伴随着多种病理生理过程，其中，细胞凋亡被认为是主要机制之一。研究证明严重的神经元细胞死亡，主要发生在海马区域［14-15］。通过观察，PTZ诱导癫痫大鼠海马细胞的凋亡，与癫痫发作的强度是一致的。通过HE染色和TUNEL法染色结果，草果知母汤对此具有一定的改善作用。而其抗惊厥作用，与之前研究一致［2-4］。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一类长度约22个核苷酸组成的内源性非编码RNA，miRNA通过与靶基因的特定序列相互作用，在转录后抑制活性或者使其降解，调节靶基因的表达。近年来，越来越多的miRNAs被发现，并被认为参与调控神经分化、生物发育、细胞增殖和凋亡等过程，是细胞增殖分化过程中重要的调控因子。有研究表明miR-21、miR-29通过调控线粒体凋亡途径中的多种蛋白来参与调控细胞凋亡［16-18］。因此为了进一步探索草果知母汤保护作用的可能机制，我们研究了草果知母汤对miR-21、miR-29和细胞凋亡相关基因的mRNA和蛋白质表达的影响，结果表明草果知母汤可通过下调miR-29、上调miR-21的表达进而调节线粒体凋亡途径中相关基因的表达而发挥抗癫痫作用，同时，Bax、P53 mRNA表达有不同程度降低，Bcl-2 mRNA和蛋白表达有不同程度增加。

总之，草果知母汤可显著降低PTZ诱导的癫痫发作，通过下调miR-29、上调miR-21的表达靶向调节凋亡相关基因Bax、P53和Bcl-2表达，抑制细胞凋亡而发挥抗癫痫作用。草果知母汤是治疗癫痫的潜在候选药物，由于其成分复杂，其抗癫痫作用是多成分、多靶点、多途径的，相关机制尚需进一步研究。