析因设计解析祛斑中药复方体外干预黑色素生成的主效应中药

陈志春 ，张理平 ，王英豪 ，杨 策 ，兰明金

（1.福州屏山制药厂，福建 福州 350003；2.福建中医药大学，福建 福州 350122）

色素增多性皮肤病是临床上一类常见的皮肤病，有文献［1］报道，仅黄褐斑在妊娠妇女中的发病率就高达53%，因此如何找寻有效抑制黑色素合成的天然药物是目前研究的科学热点之一。中药复方活性成分复杂，药理作用往往呈现出多环节、多途径的特点，课题组认为这也正是其针对色素增多性皮肤病的复杂病理，具有较好综合疗效优势的重要原因，在前期的实验研究中亦证实了祛斑中药组方治疗色素增多性皮肤病的疗效确切，且呈现出多途径、多靶点的特点［2-5］。但如何剖析复方中不同作用环节或途径的主效应中药或物质基础，揭示药效与其物质基础的相关性，亟待解决。因此本研究在前期实验［6］的基础上，从自由基清除作用、SOD样活性、抗紫外线催化作用和促黑色素分解作用等不同作用途径为切入点，深入剖析组方中干预黑色素合成不同作用环节的主效应中药，为研究治疗色素增多性皮肤病药物提供实验依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器 UV236B中波紫外线照射仪（德国Waldman公司）；FA20004N型电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）；UV-9100型紫外-可见分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；Anke TDL80-2B型离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH.S型数显水浴锅（上海锦屏仪表有限公司）；KQ-500E型超声仪（昆山市超声仪器有限公司）；PIPETTOR微量移液器（WKY型 100～500 μL，上海求精生化试剂仪器有限公司）。

1.2 试药 山楂、山茱萸、当归等药材均购于福建中医药大学国医堂，经鉴定：山楂为蔷薇科植物山里红 Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.的干燥成熟果实；山茱萸为山茱萸科植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉；当归为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根。左旋多巴（L-Dopa，西安润泽生物技术有限公司）；1，1-二苯基苦肼基（DPPH，美国 Sigma 公司）；黄嘌呤氧化酶（美国Sigma公司）；盐酸羟胺、次黄嘌呤、萘乙二胺盐酸盐、无水对氨基苯磺酸、醋酸、乙醇等试剂均为分析纯。

2 方 法

2.1 析因试验设计 参照前期实验［6］，本研究选用3×2析因设计表，以山楂、当归、山茱萸为考察因素，每个因素设2个水平，进行组方设计（见表1），得到表2的析因设计实验方案，其中一行为一种组方，按表中行数值取相应克数的药混合即得此组方，共8组。

表1 因素水平表g

2.2 组方的制备 将组方（山楂、当归、山茱萸等药）的饮片分别粉碎成粗粉（40目）后，按表1量分别称取适量粉末于具塞三角瓶中，并加入适量乙醇（见表 2），混匀，浸泡 0.5 h，超声提取 1 h，提取 2次。分别过滤，减压回收乙醇，制得浓度为250 g／L的药液，备用。

2.3 自由基清除作用的测定 参考文献［7］的方法，取1 mL受试物（1～8号）的制备液，分别加到1 mL DPPH （0.1 mM）溶液中，在 37℃温育 30 min，用分光光度计在516 nm处测定OD值。以乙醇代替受试物作为空白对照。自由基清除率的计算公式：

表2 析因设计实验方案

式中：Ai为1 mL DPPH溶液＋1 mL受试物；Aj为1 mL乙醇＋1 mL受试物；Ao为1 mL DPPH溶液＋1 mL乙醇（空白对照）。

2.4 SOD样活性的测定 参考文献［8］的方法，先将0.2 mL反应物A溶液（0.5 mM次黄嘌呤，10 mM盐酸羟胺）和0.8 mL受试物（1～8号）溶液［用EDTA-PBS（pH8.2）溶解受试物］，在37℃下培养10 min，接着将0.2 mL黄嘌呤氧化酶溶液（5 mU／mL）加入到上述溶液中，并将该混合物培养30 min；然后将2 mL反应物B（终浓度为 20 μMN-1-萘乙二胺盐酸盐，2 mM对氨基苯磺酸，16.7%醋酸）加入到上述混合物中，在室温下维持 30 min，用分光光度计在550 nm处测定OD值。SOD样活性用抑制次黄嘌呤氧化酶催化所产生的超氧阴离子的百分比表示。以PBS代替受试物作为空白对照。

2.5 抗紫外线催化作用的测定 参考文献［9］的方法，先将3 mL多巴溶液（0.03%）和3 mL PBS溶解的受试物（1～8号）混合，在25℃下用紫外线照射仪照射10 h，然后用分光光度计在475 nm处测定OD值。以PBS代替受试物作为空白对照。

2.6 促黑色素分解作用的测定 参考文献［9］的方法，将3 mL多巴溶液（0.03%）用紫外线照射仪照射18 h，生成黑色素后，加入3 mL用PBS稀释过的受试物（1～8号），摇匀，25℃下放置 12 h，然后用分光光度计在475 nm处测定OD值。以PBS代替受试物作为空白对照。

2.7 解析组方中主效应中药 采用SPSS16.0统计软件。析因分析采用F检验，结果以（x±s）表示，分别解析祛斑中药的自由基清除作用、SOD样活性、抗紫外线的催化作用、促黑色素分解作用的主效应、交互效应、单独效应。

3 结 果

3.1 对自由基清除作用的影响 组方对自由基清除的作用试验结果见表3。经析因分析，A、B、C因素两两交互效应见图1。图1中BC因素两条直线相互不平行，说明两因素存在交互作用，即组方对自由基清除作用存在交互效应，故需考虑交互作用。由 F 检验结果（表 4）可知：FC因素＞FA因素＞FB因素*C因素＞FB因素，其中 C 因素有统计学意义（p＜0.05）；A、B、B*C 因素无统计学意义（P＞0.05）。 因 C 因素与B因素存在交互作用，但B*C因素P＞0.05，故只需分析主效应中药。C因素（山茱萸）的贡献度远比A因素（山楂）、B因素（当归）大，处于绝对主导地位，尤其是山茱萸水平1对自由基清除作用最强（见图1），是复方中自由基清除作用的主效应中药。

表3 各组方干预黑色素合成结果%

表3 各组方干预黑色素合成结果%

组方试验号12345678自由基清除活性抑制率60.5±3.2 17.5±1.9 50.9±3.4 31.0±5.5 47.6±4.5 22.9±3.9 52.8±5.3 13.7±2.9 SOD样活性抑制率43.2±5.1 51.2±6.4 39.7±4.3 36.8±4.0 45.9±3.9 47.9±5.5 65.5±7.1 37.9±5.6抗紫外线催化作用抑制率40.0±4.3 37.4±3.5 43.1±5.1 47.8±3.9 46.4±4.4 57.4±6.2 53.6±4.8 51.0±6.0促黑色素分解作用抑制率24.4±3.1 21.9±3.0 27.6±2.5 22.1±5.0 18.2±3.9 17.8±1.9 16.0±1.4 29.7±2.2

表4 自由基清除作用析因方差分析表

3.2 对SOD样活性的影响 组方对SOD样活性的试验结果见表3。F检验结果（表5）可知：A因素对SOD样活性影响最大，但A、B、C三因素均无统计学意义（P＞0.05）。组方对SOD样活性的抑制作用是此复方的整体效应。

3.3 对抗紫外线催化作用的影响 组方对抗紫外线催化作用的试验结果见表3。经析因分析，A、B、C因素两两交互效应见图2。图2中两条直线均相互平行，说明因素间不存在交互作用，即组方对抗紫

图1 自由基清除作用的交互作用图

表5 SOD样活性析因方差分析表

外线催化作用不存在交互效应，故只需考虑各因素的主效应作用。由F检验结果（表6）可知：FA因素＞＞FB因素＞Fc因素，其中 A 因素有统计学意义（p＜0.05）；B、C 因素无统计学意义（P＞0.05）。可见 A 因素（山楂）的贡献远比B因素（当归）、C因素（山茱萸）大，处于绝对主导地位，尤其山楂水平2对抗紫外线催化作用具显著抑制作用（p＜0.05），见图2，是复方中抗紫外线催化作用的主效应中药。

表6 抗紫外线催化作用析因方差分析表

图2 抗紫外线催化作用的交互作用图

3.4 对促黑色素分解作用的的影响 组方对促黑色素分解作用的试验结果见表3。F检验结果（表7）可知：A因素对促黑色素分解作用的影响最大，但A、B、C三因素均无统计学意义（P＞0.05）。组方对促黑色素分解作用的抑制作用是此复方的整体效应。

表7 促黑色素分解作用析因方差分析表

4 讨论

色素增多性皮肤病是皮肤科、美容科常见的疑难病症，现代医学治疗多采用维甲酸、壬二酸、曲酸、止血环酸、果酸、抗坏血酸等药物，祖国医学治疗则常用山茱萸、黄芩、红花、大黄等中药，但迄今为止中西医都尚无疗效确切的治疗良药［10-11］。祛斑中药复方是课题组治疗色素增多性皮肤病的常用验方，前期实验表明其对酪氨酸酶的活性有很强的抑制作用［2-5］，故推测祛斑中药复方的多途径、多靶点的作用特点，是其综合治疗色素增多性皮肤病的特色和优势。尽管该复方是基于临床实践以及相关组方配伍理论而建立的，但其多途径、多靶点药理效应终究是其复杂的、特定的物质基础反应。因而，我们进一步剖析了祛斑中药复方不同作用途径的主要中药，发现山茱萸是方中酪氨酸酶活性抑制、多巴自动氧化抑制的主效应中药［6］。

然黑色素合成是一个较为复杂的过程，该过程除与酪氨酸酶、多巴色素自动氧化等因素密切相关外，还与自由基、黑色素降解及紫外线等因素密切相关。因而本实验又进行了DPPH自由基清除作用及SOD样活性的研究。DPPH自由基清除试验和SOD样活性试验均是针对自由基的，前者消除的是中等稳定的DPPH自由基，后者消除的则是极不稳定的超氧阴离子。本研究结果表明：组方对自由基均呈现出一定的抑制作用；对超氧阴离子的抑制是组方的整体效应；而对DPPH自由基，各药抑制率依次为 FC因素＞FA因素＞FB因素*C因素＞FB因素， 山茱萸的贡献度远比山楂、当归大，处于绝对主导地位，山茱萸对DPPH自由基抑制明显（p＜0.05），是方中自由基清除作用的主效应中药。本实验还进行了促黑色素分解作用及抗紫外线催化作用的研究，结果表明：促黑色素分解作用是组方的整体效应；各药对抗紫外线催化作用的抑制率依次为FA因素＞＞FB因素＞Fc因素，山楂的贡献远比当归、山茱萸大，处于绝对主导地位，山楂对抗紫外线催化作用抑制明显（p＜0.05），是方中抗紫外线催化作用的主效应中药。

正是由于中药复方具有多途径、多靶点、多系统的药理效应，必然存在不同作用途径的主要中药或主要物质基础。本研究在前期实验的基础上进一步明确了祛斑中药复方在治疗色素增多性皮肤病不同黑色素合成途径方面的主效应中药或组合，研究结果从某种程度上印证了这一理论。这种研究模式，既对中药复方配伍的现代诠释具有重要意义，又可为高效、廉价、安全的祛斑中药研发提供思路。