VEGF-C拮抗剂对大鼠角膜新生血管的抑制及对移植物成功的影响

方廷兵 严浩 徐志蓉 冯梅 王增智

血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)作为新生血管、血管通透性密切关联的血管生成因子,可通过产生一些列的病变(新生血管、纤维组织增生、出血)影响或者破坏眼内结构、功能, 从而产生角膜病、糖尿病性视网膜病变等, 降低患者视力, 甚至引起失明。其中, 角膜病是常见的致盲疾病, 目前临床对于该病的治疗, 有靶向生物制剂、角膜移植等, 角膜移植常伴随不同程度的免疫排斥反应, 由于手术、炎症等内外界因素可刺激患者角膜血管和淋巴管生成, 破坏前房免疫屏障, 从而对角膜植片产生免疫排斥［1］。VEGF-C拮抗剂可有效抑制角膜新生血管的生成,从而降低排斥反应程度, 提高角膜移植成功率。本次实验将以大鼠为模型, 进一步验证VEGF-C拮抗剂(贝伐单抗)对大鼠角膜新生血管的抑制效果, 以及对角膜移植物成功的影响, 为其临床的应用提供指导。报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 健康SPF级Wistar、SD大鼠各48只, 体质量为180～220 g, 雌雄各半, 均购自上海斯莱克实验动物有限公司,生产许可证SCXK(沪)2015-0018。所有实验操作遵守动物伦理委员会发布的伦理及管理指南。实验前使用裂隙灯检查大鼠双眼, 排除新生血管、角膜瘢痕等疾病。

1.2 实验方法

1.2.1 异种角膜移植 以SD大鼠为角膜供体, Wistar大鼠为角膜受体, 对大鼠角膜右眼行穿透性移植, 具体操作：①散瞳：大鼠置于避光环境中, 并于术前约20 min采用复方托吡卡胺滴眼液点术眼3次, 以散开瞳孔。②麻醉消毒：腹膜内注射戊巴比妥钠进行麻醉, 安尔碘消毒术眼周围皮肤及毛发,并用生理盐水冲洗大鼠结膜囊。③穿透性角膜移植术：在40倍放大的显微镜视野下选择直径3.5 mm的环钻, 以便角膜中央形成印迹, 用1 ml注射器针头适宜角度穿透角膜, 并注入玻璃酸钠, 然后沿环钻印迹剪下角膜植片, 置于0.9%生理盐水中。然后在Wistar大鼠角膜中制备植床, 使用尼龙线间断缝合约10针以固定植床与角膜植片, 手术期间注射玻璃酸钠, 术后吸除前房用于维持前房深度玻璃酸钠, 并注射无菌空气形成前房, 涂上氧氟沙星软膏, 缝合眼睑, 24 h后拆除眼睑边缘缝线。术后30 d内定期用妥布霉素滴眼液进行抗感染, 4次/d, 1滴/次。

1.2.2 动物给药 Wistar大鼠随机分为低剂量组(给予贝伐单抗5 mg /kg)、中剂量组(给予贝伐单抗10 mg /kg)、高剂量组(给予贝伐单抗15 mg /kg)和对照组(于尾静脉注射等体积生理盐水), 每组12只。异种角膜移植成功后, 术后每周尾静脉近似体积注射给药1次后, 连续给药4周, 于第28天观察VEGF-C的表达量, 角膜新生血管最长长度、新生血管面积, 并统计角膜移植物成功率。采用酶联免疫吸附法测定VEGF-C的表达量。

1.3 观察指标及判定标准 比较四组大鼠角膜新生血管面积、角膜新生血管最长长度、VEGF-C平均光密度值及角膜移植物成功率。其中角膜移植物效果参照Larkin法对各组角膜植片进行评估, 即分别对角膜不透明度、角膜水肿、角膜新血管形成情况进行评分, 若三个指标总评分＞5分, 则表明发生了角膜移植排斥反应, 移植失败。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验；计数资料以率(%)表示, 采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 四组角膜新生血管最长长度、新生血管面积比较低剂量组、中剂量组、高剂量组角膜新生血管最长长度、新生血管面积均低于对照组, 且高剂量组新生血管面积为(8.63±0.74)mm2, 显著低于低剂量组的(12.15±1.37)mm2, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.2 四组VEGF-C平均光密度值及移植成功率比较 低剂量组、中剂量组、高剂量组VEGF-C平均光密度值均显著低于对照组, 且高剂量组的VEGF-C平均光密度值显著低于低剂量组, 高剂量组、中剂量组移植成功率显著高于对照组,差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表2。

表1 四组角膜新生血管最长长度、新生血管面积比较( ±s)

表1 四组角膜新生血管最长长度、新生血管面积比较( ±s)

注：与对照组比较, aP＜0.05；与高剂量组比较, bP＜0.05

低剂量组 12 1.43±0.24ab 12.15±1.37ab中剂量组 12 1.02±0.19a 9.83±0.96a高剂量组 12 0.83±0.14a 8.63±0.74a对照组 12 2.12±0.26 15.35±1.42

表2 四组VEGF-C平均光密度值及移植成功率比较［ ±s, %(只)］

表2 四组VEGF-C平均光密度值及移植成功率比较［ ±s, %(只)］

注：与对照组比较, aP＜0.05；与高剂量组比较, bP＜0.05

低剂量组 12 25.43±8.04ab 66.67(8)中剂量组 12 21.02±7.59a 83.33(10)a高剂量组 12 17.83±7.14a 91.67(11)a对照组 12 35.12±9.26 50.00(6)

3 讨论

眼球作为新生血管性疾病高发器官, 为保证眼球屈光系统的透明性, 正常的角膜不存在血管系统［2-5］。角膜的病变或者其他原因刺激角膜血管的形成, 导致角膜透明性、视力降低, 甚至引起患者失明。血管内皮生长因子、转化生长因子、成纤维细胞生长因子等各种生长因子在诱导新生血管过程中起重要作用, 其中血管内皮生长因子作用更为显著, 主要通过促进血管内皮有丝分裂而诱导血管新生［6-10］。目前,以靶向生物制剂为主的血管内皮生长因子拮抗剂在治疗血管新生、血管通透性增加为主的眼内疾病中逐渐显现出独特的疗效优势, 而且还能有效降低角膜移植排斥反应, 促进患者预后, 提高手术成功率和视力。

本次研究显示, 低剂量组、中剂量组、高剂量组角膜新生血管最长长度、新生血管面积均低于对照组, 且高剂量组新生血管面积显著低于低剂量组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。低剂量组、中剂量组、高剂量组VEGF-C平均光密度值均显著低于对照组, 且高剂量组的VEGF-C平均光密度值显著低于低剂量组, 高剂量组、中剂量组移植成功率显著高于对照组, 差异具有统计学意义(P＜0.05)。表明VEGF-C拮抗剂可有效抑制VEGF-C的表达、大鼠角膜新生血管, 阻碍大鼠角膜新生血管的生长, 且随着VEGF-C拮抗剂剂量的增加, 抑制效率呈现一定程度的增加趋势, 从而降低新生血管对角膜的侵袭和角膜移植排斥反应, 提高移植成功率。

综上所述, VEGF-C拮抗剂对大鼠角膜新生血管的抑制效果显著, 可有效降低降低角膜移植排斥反应, 提高移植成功率。