食品中苦味物质检测方法的研究进展

金文苑 胡新中

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，西安 710119)

苦味指由奎宁、咖啡因等物质产生的一种基本味道[1]，普遍存在于食品中。天然毒素几乎都带有苦味，出于趋利避害的本能，人类向来抵触苦味物质[2]。尽管目前市场上如咖啡、酒类、茶等有苦味的食品很受欢迎，大多数情况下，消费者难以接受有苦味的食品，如苦味浓烈的奶酪、杏仁、果汁等。

食品中的苦味物质来源广泛，且多为天然产物及其衍生物，如苦荞中的槲皮素[3]，柑橘中的诺米林素、柚皮苷和柠檬苦素[4]，葫芦科植物中的葫芦素[5]，橄榄中的橄榄苦苷[6]等。此外，食品在加工、储藏或微生物作用过程中也会产生苦味物质，表1中列举了一些常见的苦味产生途径。由于食品中的苦味来源复杂，含量极低，所以在实际生产加工及品质控制过程中苦味物质的检测极具难度。

目前，食品苦味强度检测大多通过对食品体系中苦味组分的定量检测实现。如，苦味物质奎宁的定量检测通过HPLC[12]、LC-MS/MS[13]、GS-MS[14]等方法实现。定量检测苦味组分要求苦味组分为已知物质，对于未知苦味物质，需通过其他方法检测苦味强度。此外，食品体系大多成分复杂，可能同时含有多种苦味物质，体系中不同组分的化学互作也可改变其感官特性。因此，苦味强度常通过感官分析等方法直接测定。本文根据苦味检测方法的原理、适用范围等将其大致分为：感官分析、生物评价、动物评价和仪器评价四大类。其中，生物评价包括细胞检测器，纳米检测器和“气管味蕾”检测器等；动物实验包括行为分析和电生理学实验等。

1 感官分析

感官分析实验具有结果表述详细，能充分反映样品特性等优点，是目前应用最广泛的苦味物质分析方法。正确开展苦味物质的感官分析实验必须具备合格的感官分析实验室和评价员。

感官分析实验室对检验区、样品准备区、办公室等的布局有严格要求，需按标准控制温度、湿度、噪声、气味、装饰、照明等因素[15]，一个合格的感官分析室通常造价不菲。

评价员需经过挑选和培训后方能参与实验。为让评价员熟悉各类苦味物质，针对苦味的感官培训常涉及多种苦味溶液，如硫酸镁、水杨酸、咖啡因溶液等。硫酸镁溶液代表苦味持续时间短的金属类苦味物质；水杨酸溶液代表苦味持续时间长、主要在舌后部和喉部被感知的苦味物质；咖啡因溶液代表苦味持续时间长、可被整个口腔感知的苦味物质[16]。

国际上量化苦味强度的方法主要有阈值检验和标度法两种。阈值检验通常以评价员感知到的样品最低浓度为最低阈值，以不能让感官评价员感知到的样品最高浓度为最高阈值，实验前均需通过预实验确定待测溶液的浓度范围，实验结果也需重复测定1～2次，最后将所得最低阈值和最高阈值的均值作为每个评价员对该溶液的阈值检验值[17]。标度法一般以不同浓度的苦味溶液作对照，通过数字或表述程度的词描述苦味强度[17]。如Liu等[8]以15分为标度，将质量比为0.03%、0.08%和0.15%的咖啡因水溶液的苦味强度分别定为2、5和10，以此为对照检测样品苦味强度。为确保实验结果的有效性和可靠性，通常要求实验遵循下述两点要求：1) 标度应覆盖所有味觉强度，并让样品分布相对离散，体现出样本之间味觉强度的差异[17]。2) 确保评价员不对某个样本产生心理预期，且评价员始终以相同的方法评价样品[17]。标度法在实际操作中依然面临诸多问题。例如，评价员会下意识避开标度最小或最大的刻度，使各样品得分集中在中间刻度，导致实验结果无法准确体现出样品间的差异[17]。表2列出了一些利用感官分析量化苦味强度的案例。

表2 感官分析在苦味物质检测中的应用

影响感官分析结果准确性的因素较多，包括基因型，生理因素，心理因素等。人对苦味物质的感受取决于基因，人的苦味受体基因基本相似，但存在差异，这些差异导致了人对某些苦味物质的感受不一致。典型的例子有丙基硫尿嘧啶(PROP)，由于基因型的差异，一部分人天生对PROP很敏感，他们难以接受咖啡因、柚皮苷等苦味物质。同时，他们对西柚汁、十字花科的蔬菜、茶等的接受度也低于常人，而对PROP不敏感的人则没有这些体验[24-26]。此外，感官分析的结果也受到生理因素和心理因素的双重影响，生理因素主要包括适应现象、感官增强、感官抑制等，心理因素则包括期望错误、刺激错误等[17]。若评价员身体不适，也会对实验结果造成不同程度的影响[17]。为提高感官结果的准确度，Susanne等[27]建立半舌测试法，即评价员仅使用半侧舌头来接触被测溶液，而另外半侧舌头接触空白对照。此法应用广泛：如测定可可豆中有苦味的黄烷-3-醇及糖苷类物质的阈值[28]；测定3种花青素(原花青素、没食子单宁、鞣花丹宁)的涩味阈值[29]等。

滋味稀释分析(Taste dilution analysis，TDA)是一种利用感官分析确定食品中滋味物质阈值的方法[30]。为研究食品中苦味物质的具体成分，常将此法与分离、提纯、鉴定等操作结合：先将食品中的各组分分离、提纯，再利用此法评价各组分的苦味强度，筛选出有苦味的组分后再进行结构鉴定。但是，利用此法评价分离、提纯的食品组分具有一定安全隐患，因为分离提纯操作大多使用有害化学试剂，如Liu等[8]在小麦蛋白水解物苦味肽的分离纯化中以甲醇作为制备液相的流动相，Güntherjordanland等[31]用正己烷、甲醇、甲酸等提取分离燕麦中的苦味生物碱和苦味皂苷。提取物浓缩后，试剂中的不挥发性杂质在浓缩物中富集，埋下安全隐患。因此，一般需对浓缩物进行核磁共振和色谱鉴定，确保样品中不含有害物质后再进行感官分析[31]。

感官分析是苦味物质检测最常用的方法，此法结果表述详细，能充分反映样品特性。样品适用范围广，能检测几乎所有对健康无害的物质。但此法成本高，不适用于快速检测或大规模检测，且实验开展时需要考虑安全性等问题。

2 生物评价

2.1 细胞检测器

苦味受体(T2Rs)是一类在口腔中表达的负责苦味传导的G蛋白偶联受体(GPCRs)，有25种亚型[32]。当苦味物质进入口腔后，会与味蕾中相应的苦味受体结合，引起苦味受体构型改变从而激活胞内异源三聚体G蛋白，导致G蛋白中的Gα味蛋白与β3γ13二聚体相互分离；其中，Gα味蛋白激活磷酸二酯酶从而降低cAMP含量，β3γ13二聚体激活磷脂酶Cβ2(PLCβ2)；PLCβ2催化磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)分解为肌醇三磷酸(IP3)和二酰甘油(DAG)；产生的IP3激活IP3特异性受体(IP3R)，使内质网释放钙离子，钙离子浓度升高打开了瞬时受体电位离子通道蛋白5(TRPM5)，使细胞发生去极化，释放神经递质，从而将刺激传递给大脑[33]。见图1。

图1 人体苦味传导机制图

基于人体苦味传导机制，将苦味受体TAS2Rs和Gα质粒DNA共转染HEK293细胞即得到了可识别特定苦味物质的细胞，利用荧光染料对细胞内钙离子染色后，一旦此细胞接触特定苦味物质，细胞内钙离子浓度即发生变化，引起细胞荧光强度变化，分析荧光强度可得到苦味物质的浓度。一种苦味受体能特异性识别一部分苦味物质，若要鉴定所有苦味物质，需将25种苦味受体基因全部转入细胞中。但是，随转染物质增多，转染效率下降，故目前多数案例仅将一个苦味受体转入细胞内。表3列出了细胞检测器的一些构建实例。

表3 细胞检测器在苦味物质检测中的应用

细胞检测器在体外模拟了人的苦味传导通路，准确度和灵敏度与感官评价法接近。与感官评价法相比，此法的优点是：1) 由于细胞检测是体外实验，故可检测毒性未知且不适合感官评价的物质；2) 细胞检测器可实现高通量检测，提高了检测效率；3) 此法是微量检测法，节省样品，适用于检测食品中分离提纯得到的单一组分。此法的缺点是：1) 细胞检测器的制作过程复杂，技术要求高，成本高；2) 若要全面检测苦味物质，需构建全套25个转基因细胞；3) 需考虑待检测物质对细胞的毒性。目前，该技术多应用于医药等高附加值研究领域，在食品领域的应用尚少。相信随着一些技术的不断成熟与发展，这一高灵敏度的苦味检测手段会逐渐在食品领域普及。

2.2 纳米检测器

苦味物质进入人口腔中后，选择性结合苦味受体，而细胞检测器并没有考虑这一过程。为了充分模拟苦味物质进入人体口腔后发生的一系列变化，Kim等[38]以单壁碳纳米管为材料制成了一种可检测苦味物质强度的场效应晶体管检测器。单壁碳纳米管是一种由单层石墨片沿六边形轴向的不同取向卷曲形成的无缝、中空的一维碳纳米材料，按导电性不同可以分为金属性和半导体性单壁碳纳米管，其中，半导体性的单壁碳纳米管可用作场效应晶体管的传导通道[39]。场效应晶体管是一种具有电子开关功能的电子元件，广泛应用于传感器、信号发射器等装置[40]。Kim等[38]将人苦味受体蛋白TAS2R38和脂质膜固定在单壁碳纳米管场效应晶体管上，制成了可选择性检测苦味物质的检测器。当此装置接触到特定苦味物质时，TAS2R38与苦味物质结合，引起TAS2R38结构改变，导致单壁碳纳米管场效应晶体管与金属电极间的接触电阻发生变化，引起电信号改变，经过信号转换可得到该物质的苦味强度。

除单壁碳纳米管场效应晶体管外，其他纳米材料也被应用于苦味检测器的制备。与上述方法类似，Song等[41]将TAS2R38以共价结合的方式固定在羧基化聚吡咯纳米管场效应晶体管上，制成一种苦味检测器，利用此检测器检测多种呈味物质(阿斯巴甜、蔗糖、谷氨酸、糖精、PTC、PROP、尿嘧啶、苯脲等)后发现，此检测器的选择性与人类相似，且灵敏度高。此外，Wu等[42]将苦味受体蛋白TAS2R4固定在经过修饰的石英晶体微天平上，并发现苦味物质苯甲地那铵在检测器上的响应值表现出剂量依赖性。

纳米检测器与细胞检测器的原理相同，故适用范围一致。两种方法的主要区别在于：纳米检测器模拟了口腔对苦味物质的选择性，但细胞检测器未考虑此过程。

2.3 “气管味蕾”检测器

苦味受体除了存在于口腔中，还存在于其他组织中。Deshpande等[43]发现特定的苦味物质可诱发气道平滑肌细胞内钙离子浓度增加，进而引起气道平滑肌细胞的舒张和气道扩张。通常细胞内钙离子浓度增加会导致细胞收缩，故认为是大电导钙激活型钾通道开放引起了上述现象。Zhang等[44]发现Deshpande等[43]在实验中使用的苦味物质氯喹可以阻断大电导钙激活型钾通道，此通道开放引起气道平滑肌细胞舒张和气道扩张的猜想被推翻。目前针对该现象普遍认可的观点是：苦味受体在气道平滑肌中能激活两个相反的钙离子通路[33]。

人体气道平滑肌细胞中，除苦味受体基因外，与味觉有关的其他基因皆不表达[43]。气道平滑肌中表达量最高的是第10、14、31号苦味受体；而第4、5、19号苦味受体也会选择性表达[45]。基于此，朱友伟[46]通过提取猪气道平滑肌苦味受体构建了“气管味蕾”苦味检测器，此检测器可根据苦味受体与苦味物质的结合量推测物质苦味强度。此外，该检测器还检测了掩味剂磷脂酸、苯甲地那铵等对苦味受体与盐酸奎宁结合的影响，发现部分掩味剂效果不显著。

苦味受体除在气管平滑肌中表达外，还在人和动物的其他器官组织中有表达。表4中列举了一些检测到苦味受体表达的组织或器官。目前，将非口腔组织中的苦味受体应用于苦味检测的案例较少：仅Hu等[51]用小鼠睾丸细胞构建了苦味检测器，该检测器对不同浓度的苦味溶液响应信号呈剂量依赖性，且该检测器对酸、甜、咸、鲜味的溶液无响应。此类检测器与细胞检测器相比，省去了将苦味受体基因转入细胞的过程，降低了实验的操作难度，且适用于几乎所有物质的检测，故有良好的市场前景。

表4 苦味受体表达部位

3 动物评价

苦味检测的相关动物评价方法可分为不涉及手术的行为分析和涉及手术的电生理学实验[52]等，其中，行为分析可分为双瓶偏好实验[53]和简短摄取实验[54]。

双瓶偏好实验即一种通过测定动物对苦味溶液的舔舐次数[55]或摄取量与总量的比值[56]对苦味程度进行定量分析的方法。此方法虽然被普遍采用，但具有低通量和针对性不强的缺点。每次实验需要大量的准备时间，且此类实验的干扰因素颇多，无法针对性说明被测溶液的某一特定感官特性[57]。

苦味物质的简短摄取实验即一种通过反复对小鼠进行苦味刺激(5～30 s)，用特制的味觉计记录小鼠的反应，通过数据分析得到该刺激味觉特性的方法[58]。与双瓶偏好实验相比，该法可检测到溶液体积的微小变化，每只小鼠在每一次实验中的表现都能被详细记录，且实验结果的反应指标有多个，这些都有助于减少实验中异常数据的产生[57]。Jr等[59]用双瓶偏好实验及简短摄取实验同时研究小鼠舔舐次数与蔗糖浓度的关系发现，理论上小鼠对蔗糖的舔舐次数应随着蔗糖溶液浓度的增大而增加，但是在24 h双瓶偏好实验中，量效关系曲线却呈现出倒U型，即小鼠的舔舐次数在中间浓度时达到峰值，而简短摄取实验结果则与理论值相符，因此认为简短摄取实验比双瓶偏好实验更准确。

电生理学实验即一种通过手术置入检测器，测定动物接触苦味物质后的神经冲动，将神经冲动信号进行相关转化，进而获得苦味物质的味觉特性[60]的方法。Qin等[61]将自制16通道微电极阵列植入小鼠的大脑皮层，获得一种高灵敏度苦味传感器。当小鼠摄入苦味物质后，其大脑神经网络的电生理活动可被电位监测器监测，具有不同感官特性的溶液引起的小鼠大脑的不同活动，通过分析信号，可得到各溶液感官特性。

鼠基因与人基因相似[62]，味觉系统差异不大，故鼠是苦味检测相关实验中常用的动物。另外，也有少数案例利用猪等哺乳动物进行苦味检测[63]。总体而言，利用动物替代人类进行苦味检测可在感官分析的基础上进一步扩大检测范围，一些毒性未知的物质亦可进行苦味检测。实验类型不同则结果准确性不同：动物的行为分析法会受到动物自身条件的影响导致准确度低，电生理学实验可克服这一缺点，但由于要对实验动物进行手术，故实验难度大，应用少。

4 仪器评价

电子舌是一种由传感器组成、利用数学方法处理信号、能识别多种味道的系统[64]，广泛应用于食品加工过程监测、食品新鲜度评估、食品货架期探究、食品成分鉴定和食品质量控制等研究。

电子舌的传感器阵列在接触液体样品后会产生信号变化，转变为数据后，利用多元数据分析处理，即得到该样品的感官特性。传感器阵列可分为电位传感器、伏安传感器、光学传感器和质量变化传感器等[58]。传感器的膜决定了实验结果的重现性和稳定性，膜一般由无机(多晶或硫属玻璃)或有机(类脂膜)材料制成[65]。后者易被有机溶液溶解，故不适用于高酒精度酒类中苦味物质的检测。此外，不溶于水的苦味物质无法解离出离子，故不能引起探头电势变化，其苦味值无法被检测。因而，若要检测食用油等样品中的苦味，应将样品在水中分散，震荡使水溶性苦味物质溶出后再测定。电子舌的数据处理方法主要包括主成分分析(PCA)、偏最小二乘法(PLS)和人工神经网络(ANN)等。

多数电子舌仅能对各物质进行感官特性区分，故电子舌在掺假检验[66]、成分检验[67]、食品产地区分[68]等领域应用广泛。也有部分电子舌能对每一种味觉特性进行定量描述，如tala等[18]以咖啡因、奎宁水溶液为标准对鲜食橄榄油中的苦味程度进行了打分，发现电子舌的响应值与浓度的对数呈线性相关，相关系数分别达到0.830～0.831(咖啡因)和0.830～0.980(奎宁)。Ito等[69]将11名感官评价员对不同浓度盐酸奎宁的评价结果与电子舌的检验结果进行相关性分析，发现相关系数高达0.962 1。表5列出了近年来利用电子舌进行苦味检测的一些案例，涉及苦味强度检测、苦味掩蔽、产品品种区分等。

表5 电子舌在苦味物质检测中的应用

电子舌最大的局限性在于：只能给出仪器对于待测物质的响应值，但无法描述被检测物质本身的特性[64]。自电子舌概念提出后以来，电子舌逐渐向微型化、集成化方向发展，并实现了高通量检测，其检测结果的准确度和精密度均有显著提高，尤其是区分不同样品间的差异。但电子舌处理滋味丰富的样品时依然存在局限性，滋味间的互作及检测结果的准确性依旧是困扰电子舌的难题。

5 展望

感官分析是目前苦味检测中使用最普遍的方法，能充分反映样品特性，但感官分析不适用于高通量检测且不能检测安全性未知的样品。生物评价，如细胞检测器、纳米检测器、“气管味蕾”检测器等由于技术、成本制约，目前应用较少，若能突破检测器制造的技术壁垒并进一步降低成本，这些微量检测技术将在苦味物质的微量检测市场占据主导地位。在动物评价方法中，动物行为分析误差较大，动物电生理学实验操作难度大，这些缺点限制了动物评价的发展。仪器评价虽存在检测结果不全面、对某些物质的感官特性评价不准确等问题，但能实现高通量检测，且操作便捷，若能研制出更接近人体味蕾的探头材料，并开发出能充分模拟人的味觉传导过程的程序，仪器评价将成为常量苦味检测的主流方法。