免疫亲和层析净化超高效液相色谱法测定玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇含量结果的不确定度评价
2018-09-03赵晶晶张振华吴丽华刘维波
赵晶晶 张振华 刘 青 吴丽华 徐 艳 李 敏 刘维波
(西安市粮油质量检验中心1，西安 710003) (西安市农产品质量安全检验监测中心2，西安 710066) (商洛市疾病预防控制中心3，商洛 726000)
脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)又名呕吐毒素，是镰刀菌属，尤其是禾谷镰刀菌和黄色镰刀菌株分泌产生的次生代谢产物[1]，广泛存在于小麦、玉米、大麦等霉变粮食作物及其制品中，在全球范围内的检出率和检出量都很高[2-4]。这类毒素的化学性质稳定，在加工、储存及烹调过程中很难被破坏，进入食物链后干扰核糖体肽基转移酶的活性，抑制蛋白质的合成，破坏人和动物的免疫系统[5-8]。2015年国际食品法典委员会(CAC)规定未加工谷物中DON限量为2 000 μg/kg，谷物制品中DON限量为1 000 μg/kg，谷物基婴幼儿食品中DON限量为200 μg/kg[9]，2017年我国食品安全标准规定谷物及其制品中DON的限量指标为1 000 μg/kg[10]。近年来，随着 DON污染对农产品及畜牧生产的负面影响被逐渐认识，其含量分析已成为粮食监管部门对入库、 出库粮食作物的常检项目之一[11]。由于DON的检测需要经过样品粉碎、提取、净化、淋洗、浓缩、定容等一系列过程，每一步操作都会对结果产生影响。为了确保检测结果的可信度，必须进行测量不确定度的评定。
不确定度是合理表征、赋予被测量值的分散性并与测量结果相联系的参数[12]，是完整表达、科学评价检测结果可信度的依据[13-14]。本实验参照JJF 1135—2005《化学分析测量不确定度评定》[12]和JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[15]，通过GB/T 5009.111—2016《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》[16]第二法：免疫亲和层析净化高效液相色谱法，以玉米为例，对食品中的DON的测定进行不确定度评定，建立免疫亲和层析净化超高效液相色谱法测定食品中DON的不确定度评定方法。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
玉米样品为市场随机抽样；DON标准品[质量浓度(100.00±0.3) μg/mL]pribolab公司；甲醇、乙腈(均为色谱纯)德国Merck公司；聚乙二醇(分析纯)天津科密欧化学试剂有限公司；水为一级水。
H-Class超高效液相色谱仪(配有紫外检测器)：美国Waters公司； SE602F电子天平：奥豪斯仪器(上海)有限公司；DJFSD-70 粉碎磨：上海嘉定粮油仪器有限公司；Z32HK离心机：美国HERMLE公司；HY-4调速多用振荡器：国华电器有限公司；HVF-1000型固相萃取装置：陕西奥联科技发展有限公司；TurbovapLV浓缩仪：瑞典 Biotage 公司；Milli-Q超纯水机：默克化工技术(上海)有限公司； DON免疫亲和柱：美国ROMER公司。
1.2 检测方法
1.2.1 样品前处理
样品制备、提取、净化及色谱条件，参考GB/T 5009.111—2016《食品安全国家标准 食品中脱氧雪腐镰刀菌烯醇及其乙酰化衍生物的测定》并结合DON免疫亲和柱产品说明书。
具体过程如下：分取至少1 kg样品，除杂，粉碎，过筛，使其粒径小于0.5～1 mm，制成全麦粉；使用最小分度值为0.01 g的天平，准确称取25.00 g样品于100 mL的具塞三角瓶中加入5 g聚乙二醇，加水100 mL，混匀，置于振荡器中振荡30 min后，于10 000 r/min下离心5 min；准确移取2.0 mL上清液过免疫亲和柱，用去离子水淋洗免疫亲和柱2次，每次10 mL，待液体排干后，用甲醇洗脱3次，每次0.5 mL；收集全部洗脱液于50 ℃下氮吹至近干，加入2.0 mL流动相，涡旋30 s复溶，0.22 μm滤膜过滤后上机。
1.2.2 色谱条件
色谱柱： Waters-C18(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相∶甲醇-水(20∶80，V/V)；流速：0.2 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：5.0 μL；检测波长：218 nm。
2 结果与分析
2.1 数学模型的建立
用外标法计算玉米中DON的含量，其数学模型
见式(1)：
(1)
式中：X为样品中DON含量/μg/kg；C为标准曲线得到的待测溶液中DON的质量浓度/μg/mL；V为样品最终定容体积/mL；m为样品的称样量/g；R为回收率校正因子。
2.2 不确定度来源分析
根据测定过程和数学模型的分析可知，免疫亲和层析净化超高效液相色谱法测定玉米中DON含量测定的不确定度主要来源于待测溶液中DON的质量浓度、样品定容体积、样品质量、回收率和重复性等因素，各相关不确定度如图1所示。
2.3 分析和量化不确定度分量
2.3.1 测量重复性引入的不确定度u(frep)
重复性引入的不确定度，主要受实验人员的熟练程度及仪器自身性能等因素影响[17]，包含了称量的重复性、体积的重复性、检测的重复性等，该不确定度属于A类不确定度。为了获得本次实验整体重复性的不确定度，平行测定玉米样品10次，测定结果见表1。
表1 重复性测定结果
图1 DON含量测定的不确定度来源
2.3.2 回收率引入的不确定度u(R)
样品前处理主要包括提取、离心、净化、氮吹、复溶等步骤，引入不确定度的因素较多，逐一对各环节进行不确定评定相对困难。本实验选用DON含量是1.41 mg/kg的玉米粉中呕吐毒素成分分析标准物质进行5次实验，结果见表2。
表2 DON加标回收率测定结果
2.3.3 待测溶液中DON物质的量浓度(C)引入的不确定度u(C)
C的不确定度主要由标准系列工作液配制带来的不确定度和标准曲线拟合的直线求得C时产生的不确定度两部分组成。标准系列工作液配制又包括储备液的配制和标准系列工作液配制两个过程。
2.3.3.1 储备液配制过程引入的不确定度uC-1
准确吸取1.0 mL DON标准品(乙腈定容)至10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，即为10.00 μg/mL的标准储备液。
1)标准品质量浓度引入的不确定度uCS：根据标准物质证书，本实验采用的DON标准品质量浓度CS=100.00 μg/mL，扩展不确定度U(CS)=0.3 μg/mL，(k=2)，按B类评定，属于正态分布，其标准不确定度和相对标准不确定度分别是：
表3 储备液配制过程中体积引入的不确定度
根据表3可知，标准储备液配制过程中由体积引入的合成相对标准不确定度是：
因此，标准储备液配制过程产生的相对标准不确定度是：
2.3.3.2 标准系列工作液配制过程引入的不确定度u(C-2)
准确移取2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 mL标准储备液于10 mL容量瓶中，用流动相定容至刻度并充分混匀，得到2 000、1 000、500、200、100 ng/mL系列标准工作液。
表4 标准系列溶液配制过程引入的不确定度
标准曲线配制时使用的移液器刻度误差符合JJG 646—2006 《移液器检定规程》[23]的要求。标准溶液和样品以流动相定容，属于有机液体，体积膨胀系数α取1.0×10-3/℃计算[17]，标准系列工作液配制过程中由玻璃器具和温度波动引入的不确定度见表4。
根据表4可知，由标准系列工作液配制过程产生的相对标准不确定度是：
2.3.3.3 校准曲线拟合引入的不确定度uC-3
采用5个不同质量浓度的DON标准溶液，分别用UPLC重复测定3次，得到相应的峰面积Ai，利用Excel软件拟合得到线性回归方程为Ai=aCi+b，其中a为斜率，b为截距，测定结果及计算数据见表5。
表5 标准曲线数据
选取2.3.1节中的样品1待测液进行3次(m=3)平行测量，其测定结果见表6，则由标准工作曲线拟合所产生的不确定度如式(2)所示。
表6 样品中DON含量平行测量结果
(2)
综上所述，由待测溶液中DON物质的量浓度引入的合成相对标准不确定度是：
2.3.4 体积量取引入的不确定度u(V)
表7 体积量取引入的不确定度
根据表7可知，由样品定容引入的相对标准不确定度是：
2.3.5 样品质量(m)引入的不确定度um
m的不确定度主要来自于天平分辨力引入的不确定度um1、天平校准引入的不确定度um2和称量过程中的随机变化引入的不确定度um3。其中，um3已经包括在测量重复性因素ufrep。
2.3.5.1 天平分辨力引入的不确定度um1
2.3.5.2 天平校准引入的不确定度um2
因此，由电子天平称量引入的合成相对标准不确定度是：
.001 67。
2.4 相对标准不确定度的合成
各不确定度分量相互独立，不需要考虑分量间的相关性，则玉米中脱氧雪腐镰刀菌烯醇的合成相对标准不确定度是:
其中各分量汇总及对合成相对标准不确定度的相对贡献见表8。
2.5 扩展不确定度及结果表示
依据JJF 1135—2005，对于大多数测量采用包含因子k=2(95%置信度)衡量，则玉米中DON含量的扩展不确定度U=urelX×X×2，由此得到免疫亲和层析净化超高效液相色谱法测定玉米中DON含量的结果，见表9。
表8 玉米中DON含量的相对标准不确定度分量与相对贡献
表9 不确定度评定结果
3 结论
通过对超高效液相色谱法测定玉米中DON含量的不确定度各分量的评定可知，影响测定结果不确定度的因素主要是质量浓度、测量重复性、体积量取，其次为测量偏差和样品称量。其中质量浓度因素中贡献最大的分量是标准曲线拟合，其次是标准系列工作液配制和储备液配制，而样品称量引入的不确定度较小可以忽略不计。因此，在实际操作过程中选用更精密的量器具、增加标准系列工作液各个点的测量次数、增加平行样的测定次数，改善标准曲线线性，减少由质量浓度和体积量取引入的不确定度；同时严格规范实验操作，提高检验人员的熟练水平并定期对所涉仪器进行检定以减少测量重复性和测量偏差引入的不确定度，从而保证检测结果的准确性。
