电分析法同时快速测定植物油中TBHQ、BHA和BHT的研究

王佳蕊 郝雅茹 李书国

(河北科技大学生工学院，石家庄 050018)

近年来BHA、BHT的动物实验研究表明，二者存在一定的安全性隐患，过量添加对人体健康有害，人工合成抗氧化剂滥用也是食品安全问题之一[1-2]。目前抗氧化剂的检测方法有薄层层析法、比色法、气相色谱法、液相色谱法、分光光度法等，各方法都需采用有机溶剂从样品中将组分萃取分离出来，手续冗长，步骤多，不但繁杂，而且造成组分损失多，对结果的准确性影响大[1]。

电分析技术具有高的选择性和灵敏度、检测快捷方便的特点，在复杂体系中检测微量化合物、有毒有害物质、生物性成分方面得到了应用，而酚类抗氧化剂都是电活性物质，电分析技术在抗氧化剂定量分析和抗氧化活性评价方面应用潜力巨大。国外学者对该法在抗氧化剂的定量分析进行了研究，认为是替代高效液相色谱法的重要方法。Agui等[3]利用微分脉冲伏安法同时测定脱水马铃薯片中的BHA和BHT的含量，二者在碳纤维微电极上的氧化峰电位差为300 mV；Fuente等[4]利用镍酞菁修饰电极的催化作用测定油炸土豆片和玉米片中的TBHQ和BHA的含量，研究了聚吡咯修饰电极对TBHQ和BHA的电化学催化作用，确定了影响TBHQ和BHA氧化峰的主要因素，并应用于实际样品的分析检测，该法需要样品粉碎、甲醇提取、离心分离等预处理步骤。Martin等[5]借助PLS法利用微分脉冲伏安法同时测定样品中的BHA和PG；Diaz等[6]以酸性乙腈和水的混合物为介质，利用线性伏安法和PLS法同时测定了调味粉样品中BHA、PG、BHT的含量，但该法需要研磨、筛分、提取、过滤等预处理；Ni等[7]利用电分析方法辅以化学计量学技术同时测定食用油和调味粉中的BHA、BHT、PG和TBHQ，但需要用乙腈从食用油和调味粉中提取、分离抗氧化剂，并且4种抗氧化剂在其选择的介质和电极条件下，发生氧化峰重叠现象。

本实验旨在研究BHA、TBHQ及BHT 3种酚类抗氧化剂的循环伏安性质、电极反应过程与机理，优化电分析法测定3种抗氧化剂的分析实验条件，考查3种抗氧化剂的电分析信号之间相互干扰情况，验证电分析法测定油脂抗氧化剂的可靠性。

1 材料与方法

1.1 化学试剂与材料

叔丁基羟基茴香醚(BHA)、2，6-二叔丁基对甲酚(BHT)、特丁基对苯二酚(THBQ)、硫酸、无水乙醇、1，2-二氯乙烷、高氯酸锂、乙酸：分析纯；甲醇：色谱纯；大豆油、花生油、菜子油、葵花子油、芝麻油：一级油。

1.2 仪器与设备

PAR 270电化学系统(EG & G M283型恒电位仪/恒电流仪、方正电脑及操作软件M270电化学软件)；三电极系统包括：玻碳圆盘电极为工作电极(直径为3 mm)、铂丝电极为对电极、Ag/AgCl电极为参比电极；电化学池：自制；SR8001型电子分析天平； LC-20A高效液相色谱仪[检测波长为280 nm，进样量为5 μL，流动相为甲醇+乙酸-水(1∶99)，C18色谱柱(5 μm，150 mm×4.6 mm)]；JL-60DT型超声波清洗机；QY-10型微量移液器。

1.3 方法

1.3.1 电极的处理

玻碳电极依次用1.0、 0.3、 0.05 μm的Alumina(Al2O3)粉研磨抛光，用超纯水润湿，接着进行超声清洗处理，再用超纯水和丙酮冲洗除去其表面吸附物质，使成镜面，然后在0.2 mol/L 的硫酸溶液中用循环伏安法扫描处理，扫描速度为50 mV/s，电压范围为-0.5～+1.5 V，持续扫描约10 min，得到稳定的循环伏安图后，取出用二次蒸馏水洗净，室温干燥后备用[8]。

1.3.2 标准加入法

TBHQ、BHA、BHT的标准溶液：准确称取0.166 g TBHQ、0.18 gBHA、0.22 gBHT标准品加入到100 mL的容量瓶，用无水乙醇溶解并稀释到刻度，其浓度为1.0×10-2mol/L，避光贮存备用；取0.40 mL的0.1 mol/L的硫酸乙醇溶液和1.0 mL的1.0 mol/L的高氯酸锂乙醇溶液以及适量的TBHQ、BHA、BHT的乙醇溶液分别使其浓度达2.0×10-4mol/L，加入适量体积的1，2二氯乙烷到25 mL的容量瓶，使其达到25 %的比例，最后用乙醇稀释至刻度要求。循环伏安图在-0.6～1.2 V，20 mV/s的扫描速度下记录；微分脉冲伏安图在0.2～1.2 V，在10 mV/s的扫描速度下记录。在空白样和加入标准TBHQ、BHA、BHT溶液的样品中，分别进行3次平行实验，测量并记录其氧化峰电流响应，计算其平均值做为TBHQ、BHA、BHT的氧化峰电流值。

为了得到3种抗氧化剂的线性校正曲线图，分别在5×10-6～3.0×10-4mol/L 和1.5×10-5～3.0×10-4mol/L的浓度范围内准备TBHQ、BHA和BHT的校正样品集，然后利用微分脉冲伏安法测定每个样品对应的氧化峰电流，并分别作出其校正曲线。油样的TBHQ、BHA、BHT的浓度根据TBHQ、BHA、BHT的浓度与其氧化峰电流的校正曲线来确定，然后根据油样的量换算成油脂中的抗氧化剂含量。

1.3.3 HPLC法测定植物油中的抗氧化剂

准确称取植物油样品1.000 g加入到10 mL带塞的离心管内，加入甲醇5 mL混合均匀，以3 000 r/min的转速离心处理10～15 min，取上层溶液转移至25 mL的带塞比色管中，再加入5 mL的甲醇于植物油样品中重复提取一次，合并上层溶液，在4 ℃条件静置除去凝固脂肪，然后将上层溶液转移至旋转蒸发仪的浓缩瓶浓缩并用甲醇定容至10 mL，用0.45 μm微滤膜过滤，最后取样进行HPLC测定，每个样品进行3次平行实验。

1.3.4 电化学分析测定植物油样品的抗氧化剂

在该方法中，商品植物油样品无需任何预处理。称取1.0～2.0 g的植物油样品置于25 mL的容量瓶,随后加入0.40 mL的0.1 mol/L硫酸的乙醇溶液，1.0 mL的1.0 mol/L高氯酸锂的乙醇溶液和5 mL的1，2二氯乙烷，然后用乙醇稀释到最终刻度。混合溶液搅拌并用N2纯化5 min。每个油样做3次平行实验，计算其平均值作为最后测定的结果。除特别说明，所有实验均在(25±0.5) ℃下进行，同时都在氮气氛围下进行。

2 结果与讨论

2.1 TBHQ、BHA和BHT的伏安性质与电极反应过程

为了研究TBHQ、BHA和BHT的电化学性质，分别在-0.6～1.2 V的扫描电位范围，记录了150 μmol/LTBHQ、150 μmol/LBHA和180 μmol/LBHT在玻碳电极上的循环伏安图如图1所示，其中的支持电解质为含0.06 mol/L的LiClO4和2.0 mmol/L的硫酸溶液的乙醇与1，2二氯乙烷混合溶液。三者的循环伏安图表明，TBHQ的氧化峰电位为590 mV，BHA的氧化峰电位为710 mV，BHT的氧化峰电位为1 050 mV，而三者只有一个还原峰，其峰电位值为-90 mV，这说明本实验条件下，3种抗氧化剂的电化学性质是不可逆的；不同电位扫描速度下的循环伏安图表明，三者的氧化峰电流值随着扫描速度平方根的增加而增大，该现象说明3种抗氧化剂的电化学氧化过程属于典型的扩散控制过程；随着扫描速度的增加，氧化峰电位正移，抗氧化剂浓度增加也会使氧化峰电位正移。抗氧化物质的氧化峰电位值取决于该化合物的氧化还原性质，反映提供电子给工作电极的能力和该物质的电化学反应活化能，氧化峰电位值与其抗氧化活性呈负相关的关系，因此根据图1可知，TBHQ的抗氧化活性最高，其次是BHA，而BHT最低，这与其分子结构及酚羟基的数量有关，与其他文献研究结果一致。

注：扫描速度为20 mV/s。图1 BHQ、BHA和BHT在玻碳电极上的循环伏安图

2.2电分析法测定抗氧化剂TBHQ、BHA和BHT的条件优化

2.2.1 溶剂的选择

TBHQ、BHA和BHT属于脂溶性抗氧化剂，只能溶解于纯的有机溶剂如乙醇、甲醇、乙腈及其混合物。酸性乙腈-水和高氯酸-甲醇(1.0%)混合溶剂都被应用于测定食品中3种或4种抗氧化剂，但在这两种情况下，都要涉及食品样品的粉碎、溶解、分离、抗氧化剂的提取等预处理，并且所得到的混合物循环伏安图出现重叠现象，对分析造成不利影响。在本研究中，选择合适的介质对电分析法测定3种抗氧化剂十分重要，要求其满足以下条件：1)能够溶解适量植物油样品及其中的抗氧化剂，以获得均一的溶液；2)所用溶剂要有好的介电特性；3)能够溶解所选的支持电介质以获得导电性好的溶液，以降低迁移电流对电化学反应的法拉第电流的影响和干扰。因此，本实验分别选择了乙醇-1，2二氯乙烷混合溶剂和乙腈溶液，电解质均为LiClO4以提高分析溶液的导电性，记录其微分脉冲伏安图如图2所示。结果表明，乙腈作为溶剂时，加入油样产生分层现象，同时其微分脉冲伏安图中的TBHQ和BHA的氧化波峰发生重叠，而乙醇-1，2二氯乙烷混合物作为溶剂时，不但能较好地溶解0.5～1.5 g的油样，而且其微分脉冲伏安图的3个氧化峰峰形好，电位差较大，所以选择乙醇-1，2二氯乙烷混合物作为适宜溶剂。为了确定乙醇和1，2二氯乙烷的最佳比例，分别对不同比例的乙醇-1，2二氯乙烷溶剂(加入1.5 g油样)进行研究，结果表明，当混合溶剂中1，2二氯乙烷的比例低于25%时，加有油样的混合溶剂就会变混或出现絮状沉淀，所以选择乙醇-1，2二氯乙烷混合物作为适宜溶剂，最佳比例为3∶1。

注：1为0.06 mol/L LiClO4的乙醇-1，2二氯乙烷溶液，pH 3.0；2为0.1 mol/L LiClO4的乙腈溶液，均加入1.0 g的油样。图2 TBHQ、BHA和BHT在不同介质中的微分脉冲伏安图

2.2.2 溶液pH值对抗氧化剂伏安性质的影响

利用微分脉冲技术研究溶液的pH对抗氧化剂TBHQ、BHA和BHT的电化学响应的影响，所选pH范围为2.0～7.0，电位扫描速度为10 mV/s。以BHA为例，其微分脉冲伏安图表现出了一个峰形良好的氧化峰。峰电位随着溶液的pH值增加而下降，当溶液pH值从7.0到2.0，BHA的氧化峰电流逐渐增加到最大，然后基本保持不变。pH值对TBHQ和BHT的伏安性质的影响与此情况类似。本实验选择溶液pH 2.0为最佳值，用于进一步研究。

注：1～5分别表示pH 7.0、pH 5.0、pH 4.0、pH 3.0、pH 2.0，扫描速度为10 mVs-1，脉冲幅值为 25 mV。图3 分析底液pH对BHA氧化峰电流和峰电位的影响

2.2.3 支持电解质浓度对抗氧化剂伏安性质的影响

分析溶液中加入支持电解质有利于提高其导电性能，减小迁移电流，从而有利于电化学氧化响应电流的测定。本实验分别研究了LiCl和LiClO4对抗氧化剂的伏安性质的影响，抗氧化剂BHA在LiClO4溶液的电化学响应信号明显高于同浓度的LiCl的信号，所以本实验选择LiClO4作为支持电解质。为了确定LiClO4的适宜浓度，利用微分脉冲伏安图研究了BHA在不同浓度(0.02～0.08 mol/L)LiClO4的伏安性质。如图4所示，BHA的微分脉冲伏安图在所研究的电位范围内，表现出一个峰形良好的氧化峰，峰电流随着支持电解质浓度的增加，BHA的氧化峰电流显著增大，这主要归因于溶液的导电性能的提高，此外背景电流有所下降。BHA的氧化峰电位略微向负电位方向移动。TBHQ和BHT的伏安性质对支持电解质浓度变化的响应与BHA类似，在其后的实验研究中选择0.08 mol/L LiClO4。

注：1～4分别表示0.02、0.04、0.06、0.08 mol/L LiClO4，pH 7.0，电位扫描速度为10 mV/s，脉冲幅度为25 mV。图4 BHA在不同支持电解质浓度的溶液中的微分脉冲伏安图

2.2.4 电分析仪器参数对抗氧化剂伏安性质的影响

微分脉冲伏安技术由于其能有效地降低背景电流，可以提高电流测量的精确度和灵敏度，因此选择微分脉冲技术进行TBHQ、BHA和BHT的分析，TBHQ、BHA和BHT的微分脉冲伏安图如图5所示，它们的氧化峰电流随着脉冲幅度的增加而显著增加，在低电位扫描速度和较大的脉冲幅度时，其伏安图的峰形变得更尖锐、更窄、更陡，因此为了降低TBHQ、BHA和BHT之间的氧化波峰之间的重叠程度，扩大其电位差，以获得高的灵敏度，选择50 mV为最佳脉冲幅度。综合考虑测试分析速度和峰形两种因素，选择10mV/s为适宜电位扫描速度。

综合考虑，确定乙醇-1，2二氯乙烷(3∶1)，支持电解质为0.08 mol/L LiClO4，溶液的pH为2.0，电位扫描速度为10 mV/s，脉冲幅度为50 mV为最佳的电分析参数，在此条件下分析3种抗氧化剂TBHQ、BHA和BHT，可以获得3个形状良好、电位差较大的3个氧化波峰，从而获得较高的灵敏度。

注：1表示扫描速度10 mV/s，脉冲幅度 25 mV；2表示扫描速度5 mV/s，脉冲幅度50 mV。图5 不同电分析仪器参数时TBHQ、BHA和BHT的微分脉冲伏安图

2.3抗氧化剂的氧化峰电流响应与其浓度之间的关系

根据标准加入法，分别制备TBHQ、BHA和BHT的不同浓度的油样(同一浓度的油样做3次平行实验)。在选定的溶液和实验条件下即电位扫描速度为10 mV/s和脉冲幅度为50 mV，分别记录TBHQ、BHA和BHT在玻碳电极上的微分脉冲伏安图，并测量其氧化峰电流的值，每个峰电流平行测定3次并记录，计算3次测量结果的平均值，以其作为该抗氧化剂的峰电流响应。根据每一种抗氧化剂的氧化峰电流响应值对应其浓度做图，得到其线性校正模型和统计结果如表1所示，利用单因素回归分析法分析。

表1 3种抗氧化剂的氧化峰电流与其浓度之间的校正曲线

注：y表示峰电流/μA ;x表示摩尔浓度/μmol/L。

2.4 3种抗氧化剂之间电化学响应信号的相互干扰的情况

TBHQ、BHA和BHT混合物的循环伏安图和微分脉冲伏安图都表现出了3个形状良好的氧化波峰，在TBHQ氧化波峰的后半部分与BHA氧化波峰的前半部分发生小部分重叠，三者的氧化峰电位差也大于等于100 mV，一般来说，可以获得各自独立的电化学响应信号，但由于3种抗氧化剂具有相似的结构，同时相互之间具有抗氧化增效作用，在定量分析时，需要考虑相互之间的干扰情况。

进一步考查3种抗氧化剂之间的干扰程度，分别记录了同浓度的TBHQ、TBHQ和BHA混合物、TBHQ、BHA和BHT混合物的微分脉冲伏安图如图6所示。根据图6中的3个伏安图可以看出，溶液中加入等浓度的BHA会引起TBHQ的氧化峰电流响应的增加(增加约10%)，而再加入等浓度的BHT时，TBHQ的氧化峰电流响应基本保持不变，BHA的氧化峰电流略有下降，这是由于在氧化过程中，TBHQ与BHA、BHA与BHT的相互作用的结果；图6中还可以看出BHA及BHT的加入对TBHQ的氧化峰电位影响不明显，TBHQ与BHA、BHA与BHT的氧化峰电流之间产生相互干扰。化学计量法能够有效地减少或消除分析物之间的相互作用的影响，所以利用电分析技术和化学计量技术可以测定3种或多种抗氧化剂混合物中的每一种抗氧化剂。

注：1～3分别表示120 μmol/L TBHQ、120 μmol/L TBHQ+60 μmol/L BHA、120 μmol/L TBHQ+60 μmol/L BHA+130 μmol/L BHT，电位扫描速度为10 mV/s，脉冲幅度为50 mV。图6 微分脉冲伏安图

2.5电分析法结合化学计量技术预测混合样品中的抗氧化剂

偏最小二乘回归(PLS)是对一般最小二乘回归的扩展，是集多因变量对多自变量的回归建模以及主成分分析为一体的多元数据分析方法，同时对响应测量矩阵A和浓度矩阵C进行主成分分解，提取主因子，并对主因子进行回归，进一步提高了方法的可靠性。与其他方法相比，具有简单稳健、计算量小、预测精度高、所构造的潜变量较确定、易于定性解释等优点。己成为化学计量学中最受推崇的多变量校正方法之一。

2.5.1 校正模型的建立

为了利用电分析法对食用油样品中的抗氧化剂TBHQ、BHA和BHT同时进行测量，首先建立化学计量学数学模型，然后用所建立的模型对样品浓度进行预报。本实验按L9(34)正交设计，分别配制9个不同浓度配比的3种抗氧化剂的校正组标准混合溶液和5个3种抗氧化剂预测组标准混合溶液(每个浓度配比的试样配制3个)。其浓度如表2和表3所示。利用微分脉冲法依次记录每个样品的3个氧化峰电流值，每个样品分别测量3次，取其平均值作为该样品的各对应抗氧化剂的电流响应值，所测得数据用偏最小二乘法(PLS)建立数学模型[7]。

表2 TBHQ、BHA和BHT的校正组的浓度组成

2.5.2 混合模拟试样PLS法预测分析结果

用PLS法数学模型对5组浓度配比不同的3种抗氧化剂的模拟试样的各抗氧化剂浓度进行预测，浓度预测值、每种抗氧化剂相对预测误差(RPEs)、总的相对预测误差(RPET)及平均回收率等列于表3和表4。由表可以看出电分析法结合PLS法对不同浓度配比的不同模拟试样的抗氧化剂TBHQ、BHA和BHT的预测回收率分别为102.6%、101.7%、100.6%，其相对预测误差为2.39%、1.67%和1.56%，预测结果较好。

表4 PLS法预测模拟混合试样的3种抗氧化剂的回收率、

2.6电分析法结合PLS法测定实际植物油样品中的抗氧化剂

利用电分析法结合PLS技术和HPLC法同时测定了5种植物油：大豆油、花生油、菜子油、葵花子油和小麦胚芽油的抗氧化剂，2种方法的测定结果基本一致，如表5所示。2种或3种抗氧化剂组合如TBHQ-BHA或TBHQ-BHT添加入到植物油中，利用其抗氧化增效作用，提高油脂的氧化稳定性，而TBHQ是目前最常用的油脂合成抗氧化剂，在小麦胚芽油样品中没有检测到合成抗氧化剂，这可能是因为小麦胚芽油中天然抗氧化剂-生育酚含量比较高，其稳定比较好。在所测定的植物油样品中，回收率大约在94%～104.1%，这些结果表明该法在同时测定植物油中3种抗氧化剂方面是可行的，而且该法无需提取、分离及清洗等油样预处理程序，是非常有应用潜力的方法。

表5 电分析法与PLS法联用及HPLC法测定植物油样品中的食品抗氧化剂

3 结论

3.1 抗氧化剂TBHQ、BHA和BHT的电极过程属于典型的扩散控制过程，并且是不可逆的，3种抗氧化剂混合物的循环伏安图表明，TBHQ的氧化峰电位最低，其次是BHA，BHT的氧化峰电位最高，而氧化峰电位的高低表明了其提供给电极电子的能力，与抗氧化活性呈负相关，所以3种抗氧化剂的抗氧化活性依次为TBHQ、BHA和BHT。

3.2 确定了电分析法测定植物油抗氧化剂的最佳分析实验条件：乙醇-1，2二氯乙烷(3∶1)为溶剂，0.08 mol/L的LiClO4为支持电解质，溶液的pH值为2.0，微分脉冲伏安技术用于测定其氧化峰电流响应，其参数为：电位扫描速度为10 mV/s，脉冲幅度为50 mV。在此条件下确定了各抗氧化剂的氧化峰电流与其浓度之间的回归数学模型、线性检测范围、最低检测限等。

3.3 研究了TBHQ、BHA和BHT 3种抗氧化剂之间的相互干扰情况，BHA的加入会增加TBHQ的电流响应，增加量约10%，添加BHT对TBHQ的电流响应无影响，而对BHA的电流响应有一定影响，BHA和BHT的加入使TBHQ的氧化峰电位略微负移。

3.4 研究电分析法结合PLS法测定模拟试样中的抗氧化剂，其预测浓度、检测回收率和相对偏差结果，与HPLC法测定结果一致，效果较好，该法可有效消除了3种抗氧化剂之间的相互干扰，而且该法无需油样的提取、分离和清洗等预处理程序，可以作为高效液相色谱法的重要替代方法。