生物节律基因在宫颈癌中的表达及其临床意义

韩小亚 周文柏 刘建兵 龙伟 张丽娜 张玢

宫颈癌是常见的恶性肿瘤之一,在全球妇女恶性肿瘤死亡率中居第四位。在全球范围内,每年新发宫颈癌约529 800例，在发展中国家每年会导致275 100例死亡[1]。人类乳头瘤病毒高危型感染会激活致癌基因、使肿瘤抑制基因失活[2]。此外，吸烟、多个性伴侣以及卫生状况差都会增加宫颈癌发生的风险[3]。随着宫颈癌疫苗的开发，宫颈癌筛查技术的普遍应用，宫颈癌的发病率和死亡率明显下降[4，5]，但是其发病机制尚不清楚。近年来大量研究发现，生物节律维持睡眠-清醒周期、行为、代谢、激素分泌等生物行为以适当的节奏在体内运转。目前临床病例和实验数据表明，生物节律关键基因有clock（circadian locomotor output cycles kaput）、per1（period 1）、per2（period 2）、per3（period 3）、cry1（cryptochrome 1）、cry2（cryptochrome 2）、bmal1（brain and muscle ARN-t like protein 1）、npas2（neuronal PAS domain protein 2）、rev-erb α（retinoic acid receptor-related orphan receptor α）、dec1（differentially expressed in chondrocyte 1）、dec 2（differentially expressed in chondrocyte 2）和 ckiε（casein kinase I ε）、cki δ（casein kinase I δ）、tim（timeless）共计14种，当体内生物节律发生紊乱，生物钟基因可以通过调控钟控基因的表达，直接或间接参与多种肿瘤的发生发展[6]。目前仅见生物节律tim基因在宫颈癌中的研究报道[7]。本研究期望通过在宫颈癌组织中生物节律正负反馈调控基因的表达差异的研究，探讨生物节律基因在宫颈癌发生发展中的具体作用机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2015年11月～2017年8月宫颈鳞癌术后新鲜标本30例，及其对应的癌旁组织作为对照组（均经病理证实）。宫颈鳞癌患者均为初次接受手术，术前未接受放化疗，年龄39～58岁，平均47.6岁。新鲜组织标本置于1.5ml离心管中加入1ml Trizol充分混匀，室温静置5min后放入-70℃冰箱保存备用。

1.2 引物设计与合成 clock、per、cry、bmal、tim 和内标β-actin引物由本实验室设计，上海捷瑞生物工程有限公司合成，引物序列见表1。

1.3 组织总RNA制备 在冰上用组织匀浆器研磨至糊状，加入0.2ml的氯仿，剧烈摇晃后静置2min，12 000r/min离心10min后取上清，加入0.5ml异丙醇后静置10min，12 000r/min离心10min后取沉淀，加入1ml的75%乙醇漂洗后干燥，溶于DEPC水中，定量总RNA浓度。

1.4 逆转录反应 参照Takara逆转录试剂盒（RR037A）说明书操作将总RNA逆转录为cDNA。cDNA样本-20℃保存。

1.5 实时荧光定量PCR反应条件 95℃预变性1min，95℃变性 30s，62℃退火 30s，72℃延伸 1min，共35个循环；最后72℃延伸5min。所有PCR反应均在ABI 7500 PCR仪上进行。

1.6 RT-PCR产物的检测 采用1.5%琼脂糖凝胶对扩增合成的RT-PCR产物进行电泳。利用UVP凝胶成像系统对PCR产物条带进行扫描，对电泳条带灰度进行分析，将目标条带灰度与扩增的β-actin条带灰度的比值表示为各mRNA的相对表达水平。

1.7 统计学方法 采用SPSS 17.0统计学软件进行分析。mRNA相对表达水平组间对比采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

表1 生物节律基因引物序列

2 结果

2.1 宫颈癌中生物节律基因clock的变化 宫颈癌组生物节律基因clock的表达为0.41±0.04，对照组为1.00±0.00，两组比较差异具有统计学意义（t=2.65，P＜0.05）。

2.2 宫颈癌中生物节律基因bmal的变化 宫颈癌组及癌旁对照组的生物节律基因bmal的转录水平分别为0.86±0.14、1.00±0.00，两组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.3 宫颈癌中生物节律基因per的变化 宫颈癌组及癌旁对照组的生物节律基因per1的转录水平分别为0.12±0.03、1.00±0.00，表达极显著下调（t=7.22，P＜0.001）；per2基因表达分别为0.21±0.04、1.00±0.00，表达极显著下调（t=6.89，P＜0.001）。

2.4 宫颈癌中生物节律基因cry的变化 宫颈癌组及癌旁对照组的生物节律基因cry1的表达为0.12±0.03及1.00±0.00，宫颈癌组显著下调（t=2.98，P＜0.05），而 cry2的表达为 0.14±0.04与对照组相比极显著下调（t=6.98，P＜0.001）。

2.5 宫颈癌中生物节律基因tim的变化 宫颈癌组及癌旁对照组的生物节律基因tim的表达分别为2.9±0.067及1.00±0.00，宫颈癌组显著上调（t=8.52，P＜0.001）。各生物节律基因的表达见图1。

图1 生物节律基因在宫颈癌中的表达情况

3 讨论

在过去的几十年间，现行的宫颈癌筛查已经大大降低了宫颈癌的死亡率，通过筛查能早发现早诊断早治疗，现在甚至发病之前就可对其进行预防。然而随着基于生物节律基因的研究，兴起了一种新型的个体化治疗模式。研究生物节律基因与宫颈癌之间的关联性，可探寻宫颈癌的发病机制，找到更好的筛查方法及个性化诊疗方案。本研究结果表明，在人类宫颈癌发生过程中生物节律基因的转录水平存在明显差异。

众所周知，生物节律基因是由clock基因和bmal1基因通过 PAS（Per-Arnt-Sim）区域形成异二聚体，与受生物节律调节基因(包括per和cry)上游的E-box结合，启动节律性基因转录；而per与cry表达升高后，形成的异二聚体可与clock和bmal1结合，反馈性抑制其转录功能。此外，由per和tim基因编码的蛋白磷酸化后形成二聚体，在核内能够延缓转录过程。因此，clock/bmal1二聚体激活的per和cry基因的转录过程被per/tim二聚体抑制，但随着两个二聚体蛋白之间相互作用的加强，per/tim二聚体出现转变，负反馈作用减弱，转录过程被重新激活[8]。此外，tim与per1-3结合后能进入细胞核，抑制clock基因的活性，降低clock基因表达，从而终止生物钟周期[9]。

clock基因作为第一个被发现的脊椎动物生物节律基因[10]，是目前研究最多的基因。诸多研究表明，多种肿瘤的发生及进展均与clock基因密切相关。clock基因与乳腺癌发病风险显著相关[11]，在大肠癌、甲状腺癌组织中clock基因mRNA呈高表达[12,13]。本研究在宫颈癌组织中发现了与其他肿瘤相反的clock基因的表达情况，clock基因的表达在宫颈癌组织较其配对的癌旁正常组织呈显著下调，提示clock基因在正常组织中具有一定的生理作用。

目前生物节律基因per1和 per2的研究表明，其通过调控细胞周期相关基因的表达参与细胞周期的调控，并且per1和 per2的表达异常与多种肿瘤密切相关。在口腔鳞状细胞癌、弥漫性大B细胞淋巴瘤、胃癌以及乳腺癌组织中，per1和per2的表达水平均降低[14～16]。本研究中，宫颈癌组织中的per1和per2同样表现出显著下调的情况，表明存在潜在的抑制细胞凋亡，最终导致癌变。per1和per2表达下调也可能引起基质金属蛋白水解酶-2表达上调，同时加大层黏连蛋白受体-1在细胞膜上的分布，从而增强肿瘤的侵袭、迁移和转移能力。

cry基因作为生物节律基因家族中最重要的成员之一，cry1与cry2均是负向反馈调节因子。其中cry1可以不依赖于per或两者复合物，直接与clock或bmal1或clock/bmal1复合物起作用抑制转录，因此目前有学者认为cry1抑制活性强于任何per蛋白[17]。在妊娠期糖尿病、胰腺癌和结直肠癌的研究中发现cry基因与这些疾病发生并无相关性[18,19]。而本研究结果却显示cry1与cry2基因表达都发生明显下调，这可能导致了昼夜节律的紊乱，从而诱发宫颈癌的发生。

通过本研究发现，宫颈癌中多个生物节律关键基因的表达发生了变化，clock、per1、per2、cry1和cry2均表达下调，这会直接影响异二聚体所形成的相对数量，从而使节律相位发生异常，造成生物节律系统紊乱，引发宫颈癌的发生。而tim基因表达上调，应当是机体对紊乱的生物节律系统的负向调控。

综上所述，通过对宫颈癌中生物节律基因的初步研究，可知宫颈癌中的确存在着复杂的生物节律基因表达异常的情况，表明clock、per1、per2、cry1、cry2和tim均可能参与了宫颈癌的发生过程。然而，更多的机制研究将有助于进一步阐明各基因在宫颈癌发生中的确切作用，并有助于靶向治疗策略。