牛磺鹅去氧胆酸对FLS细胞中GR介导的HSP 90基因表达的影响

宝力格 ，周 蕾 ，郝大成 ，朱相成 ，罗宏亮 ，3，李培锋

（1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古 呼和浩特 010018；2.农业部动物临床诊疗技术重点实验室，内蒙古 呼和浩特010018；3.内蒙古金宇保灵生物药品有限公司，内蒙古 呼和浩特 010030）

牛磺鹅去氧胆酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）是胆汁酸（bile acids，BAs）的主要活性成分之一，是一种结合型胆汁酸。其分子式为C23（OH）2H37CONHCH2CH2SO3H，主要存在于鸡、鸭、鹅、熊等动物胆汁中，在鸡胆汁中其含量最高［1-4］。

研究表明，TCDCA具有显著的抗炎免疫调节作用［1-4］，其抗炎免疫调节作用与糖皮质激素受体（glucocorticoid receptor，GR）介导的基因组学信号通路有关［5］。热休克蛋白 （heat shock proteins，HSPs）是生物体受到环境中物理、化学、生物、精神等因素刺激时发生应激反应而合成的高度保守的蛋白质［6］。 热休克蛋白 90（heat shock protein 90，HSP90）作为HSPs最重要的成员之一，表达于所有的真核细胞，但其在肿瘤细胞中的表达比相应的正常细胞高出2～10倍［7］。同时HSP90是GR必需的分子伴侣，承担了“分子开关”的作用。GR与HSP90和免疫亲和素（IP）结合成的复合物，以未活化型存在于细胞胞浆内，当机体受到刺激后，糖皮质激素进入靶细胞，与GR受体结合后，HSP90等与受体结合的蛋白质解离。为此，进一步探讨TCDCA激活GR受体后对HSP 90表达的调节作用，可深入揭示TCDCA抗炎免疫调节作用的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

雄性SPF级SD大鼠，购自内蒙古医科大学实验动物管理中心。TCDCA，购自美国Sigma公司；弗氏完全佐剂，购自美国Sigma公司；DEME高糖液体培养基（Gibco）；胎牛血清（Excell Bio）；DPBS （Gibco）；AXYGEN总RNA试剂盒 ；RT SuperMix；FastStart Universal SYBR Green Master（Rox）购于 Roche 公司；其他试剂均为国产或进口分析纯。

表1 TCDCA对FLS细胞中HSP90mRNA表达量的影响

1.2 研究内容与方法

1.2.1 成纤维样滑膜细胞的分离和培养：按照文献［5］中的方法建立AA模型。选择体重在（100±20）g的SD大鼠进行饲养，首先让其在所处的新环境适应1周，之后待大鼠在体重大约达到（150±20）g进行造模，利用弗氏完全佐剂进行AA大鼠模型的诱导，于AA大鼠组每只鼠左后足趾皮内注射弗氏完全佐剂0.1 mL。在AA大鼠模型诱导13～15 d后，将模型评价标准判定为造模成功的大鼠处死。采用组织块贴壁法培养细胞，用含有20%胎牛血清、青链霉素的DMEM高糖培养基培养，之后每隔2～3 d换液1次，如有大量成纤维滑膜细胞长出后可移除组织块。

当原代培养的滑膜细胞连成片状时可进行传代。该试验采用胰酶消化法传代培养。每2 d换1次培养液，当细胞再次呈单层密集贴壁长满，再用同样的方法进行传代，传至3～5代时用于后续试验。

1.2.2 分组与给药：试验分组与给药见表1。

1.2.3 引物设计：根据GenBank中大鼠糖皮质激素受体 （GR）的cDNA序列 （M14053.1），应用Primer 6.0软件设计合成引物，引物由上海生物工程有限公司合成。引物序列如下：

β-actin上游 ：5′-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3′；下游 ：5′-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3′。 HSP90上游 ：5′-TCAGGGTTTATCTCCAGGTGT-3′；下游 ：5′-AAGGTTGAAAAGGTGGTTGTG-3′。

1.2.4 采用实时荧光定量PCR法检测FLS细胞中HSP 90mRNA表达量测定：待第4代的FLS细胞长满贴壁后，按照5×105cell/mL的细胞浓度加入到六孔板中过夜培养，待细胞的融合度达到80%～90%进行试验。按照AXYGEN总RNA试剂盒说明书进行RNA的提取，按照Q RT SuperMix说明书反转录得到30 μL体系的cDNA。FLS细胞中HSP 90mRNA表达量用FastStart Universal STBR Green Master（Rox）检测，按照试剂盒说明书配置20 μL q-PCR反应体系：模板 2μL，上游引物0.8μL，下游引物 0.8μL，SYBR染料6.4μL，用去离子水补至20μL。用 2-ΔCt［ΔCt=Ct（HSP 90）-Ct（β-actin）］公式计算HSP 90基因的相对表达量。反应过程采用40个循环，退火温度为58℃。

图1 TCDCA对FLS中HSP 90mRNA表达的影响

1.2.5 数据处理和统计学分析：结果以X±S表示，采用SPSS 19.0软件进行统计学分析，样本比较采用F检验，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。

2 结果

由图1可知，未加RU486诱导前，与FLS细胞对照组相比10-4、10-5mol/L的TCDCA均可极显著性（P<0.01）抑制 HSP 90mRNA 的表达；FLS细胞对照组在加入RU486后，HSP 90mRNA的表达极显著性（P<0.01）降低。同剂量的TCDCA在加入RU486后，HSP90mRNA的表达均显著（10-4mol/L）和极显著性（10-5mol/L）升高。由以上结果可以得出TCDCA可通过GR受体诱导HSP 90mRNA表达的降低，同时加入RU486后可抑制TCDCA对HSP 90mRNA的作用。

3 讨论

HSP90作为机体重要的分子伴侣蛋白在炎症反应的发生过程中具有重要的作用。研究发现，当视网膜色素上皮细胞（RPE）发生非细菌感染引起的炎症反应时，HSP90发挥着重要的促炎作用［8］。同时，在研究机体发生炎症反应的患者时，机体HSP32、HSP70和HSP90表达量发生显著性升高，由此可知炎症反应的发生可以促进HSP90的表达［9］，HSP90 是一种重要的促炎因子。 因此，该研究以AA大鼠成纤维样滑膜细胞（FLS）为研究对象，研究了TCDCA对AA大鼠FLS中HSP 90mRNA表达的影响。研究结果显示，TCDCA能够极显著 （P<0.01）抑制AA大鼠FLS中 HSP 90mRNA的表达；而当加入GR阻断剂预处理后，TCDCA对HSP 90mRNA表达的抑制效应减弱。由此可知，TCDCA可通过GR受体抑制促炎因子HSP 90基因的表达，从而发挥其抗炎作用。