RNA干扰基质金属蛋白酶-9对骨肉瘤MG-63细胞侵袭、迁移的影响

刘 丹 陈国福 刘永庆 裴宝瑞 刘 斌

(唐山市丰润区人民医院骨科，河北 唐山 063000)

骨肉瘤恶性程度高，骨肉瘤的转移率及病死率高，确诊患者有50%以上不同程度的肺部转移。虽然目前对骨肉瘤的治疗已经取得了很大的进步，但对肿瘤转移及复发等问题仍然没有有效解决，骨肉瘤患者伴有肺部转移生存率没有明显提高〔1〕。在基因治疗中寻求有效的治疗靶点成为急需解决的关键问题之一。基质金属蛋白酶(MMP)-9是锌离子依赖性蛋白水解酶家族成员之一，主要具有降解细胞外基质(ECM)和基底膜的能力，降解基底膜的蛋白——Ⅳ型胶原〔2〕，并能促进血管生成和调节细胞黏附性，促进细胞的迁移运动〔3〕，其在肿瘤的侵袭和转移中起到重要作用。研究表明MMP-9在骨肉瘤中存在过度表达的现象〔4〕。本研究选取MMP-9作为靶基因来研究其对骨肉瘤MG-63细胞侵袭、迁移的作用。

1 材料和方法

1.1材料与试剂 人成骨肉瘤MG-63细胞株由华北理工大学基础医学实验室馈赠；10%胎牛血清(FBS)、RPMI1640培养基购置于美国Gibco公司；慢病毒载体购于上海吉凯基因化学技术有限公司，shRNA-MMP-9阳性序列：5′-UCCAGGGCGAGGACCAUAGAG-3′。shRNA-MMP-9阴性对照序列：5′-ACGUGACACGUUCGGAGAAGTCT-3′；RT-PCR实验试剂盒购于美国Invitrogen公司；Matrigel 购置于BD公司。Transwell小室购置于BI公司；MMP-9和血管内皮生长因子(VEGF)一抗体和二抗体均购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2细胞培养 骨肉瘤MG-63细胞用含10% FBS、1%青链霉素的RPMI1640完全培养基，并置于37℃、5%CO2饱和湿度下培养，当细胞生长汇合至80%时可进行消化传代。

1.3细胞转染 取处于对数生长期细胞，常规消化调整细胞密度为5×106/ml接种于6孔板中，实验分为：转染组(转染shRNA-MMP-9序列)、对照组(转染shRNA-MMP-9-NC序列)、空白组〔磷酸盐缓冲液(PBS)〕。转染操作参照吉凯慢病毒转染说明书，转染48 h后在激光共聚焦显微镜下观察转染率。

1.4RT-PCR检测mRNA表达 转染48 h后收集各组细胞，参照Trizol说明书一步法提取细胞总RNA，检测RNA浓度复合实验要求后，用M-MLV试剂盒将RNA样品逆转录反应合成cDNA后，再使用SYBR试剂盒进行PCR扩增反应，引物序列MMP-9为上游：5′-CTGTTGGACTGCTGCTTTGCTG-3′；下游：5′-GTCTCCTGAAAGGTTTGGAAT-3′。β-actin为上游5′-GTTGGGACCTGAGAGACTA-3′；下游：5′-TGGCGATGTCCAGTCACACT-3′。扩增条件：93℃预变性10 min，93℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s，30个循环后再72℃延伸10 min。采用相对定量的方法对实验结果进行分析。

1.5Western印迹检测蛋白表达 转染48 h后收集对数生长期各组细胞，提取细胞总蛋白，检测蛋白浓度，每组样品取50 μg蛋白质/泳道，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，配制10%的分离胶和5%的浓缩胶，进行电转，设置250 mA 90 min将凝胶中蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜；分别滴加150 μl一抗miR-143(1∶1 000)和MMP-13(1∶2 000)及一抗β-actin(1∶1 000)，4℃过夜；三乙醇胺缓冲盐水溶液(TBST)洗涤10 min×3次；加入100 μl二抗(1∶1 000)，37℃孵育1.5 h；TBST洗膜10 min×3次。进行显色，扫描条带，Image J软件分析光密度值。

1.6Tanswell侵袭实验检测细胞侵袭能力 将4℃过夜Matrigel和4℃预冷改良Eagle培养液(DMEM)按照1∶8比例进行混匀后，铺加在小室上室面，37℃孵育30 min，使Matrigel聚合成凝胶状态，制备Transwell小室。各组细胞进行常规消化，稀释细胞浓度至5×105/ml，滴加150 μl/孔至小室的上室，下室中加入含20% FBS的完全培养液600 μl，继续培养24 h。吸掉上层小室的培养液并用棉签轻柔擦拭Matrigel胶及没有穿透的细胞，将聚碳酸酯膜小心的切取下来，常规进行苏木素染色，中性树胶封片。在200倍的光学显微镜下，随机选取出5个视野拍照并计数在每个视野中穿出膜的细胞数目，取其平均值及标准差，以此作为评估各组细胞侵袭能力的指标。

1.7细胞划痕实验检测细胞迁移能力 采用Marker笔在6孔板背面画出均匀间隔0.8 cm左右的横线，横穿过孔，每孔至少穿过5条线。各组细胞常规消化制成单细胞悬液，调整细胞密度为5×106/ml。细胞融合率达到100%时用10 μl的枪头作划痕，划痕完毕后，PBS轻洗细胞3次，漂洗去除划下的细胞，继续培养。按0，24，48 h时间点取样，拍照，用Image J软件分析培养0、48 h时的各组划痕情况。

1.8统计学方法 采用SPSS18.0软件行单因素方差分析，组间比较使用SNK法。

2 结 果

2.1细胞转染率 利用激光共聚焦显微镜检测转染效率，根据最强红色荧光判断转染率，转染率可达90%以上，证实慢病毒介导的转染方法转染率高。见图1。

图1 激光共聚焦显微镜观察转染率(×400)

2.2MMP-9和VEGF的mRNA表达 转染组MMP-9 和VEGF的mRNA表达水平相比于对照组和空白组显著降低(P<0.05)，而对照组和空白组差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 各组MMP-9和VEGF mRNA表达

与对照组和空白组比较：1)P<0.05，下表同

2.3MMP-9和VEGF蛋白的表达 转染组MMP-9、VEGF蛋白的表达水平明显低于对照组及空白组(P<0.05)；空白组与对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见图2、表2。

图2 Western印迹检测MMP-9和VEGF蛋白的表达

组别MMP-9VEGF转染组0.175±0.2261)0.152±0.1051)对照组0.328±0.0150.338±0.312空白组0.343±0.6030.356±2.205F/P值6.52/0.005.86/0.00

2.4细胞的侵袭能力 各组的侵袭细胞数分别为：转染组(56.37±3.29)个/视野、对照组(92.06±3.56)个/视野，空白组(93.05±1.52)个/视野；与空白组和对照组相比，实验组侵袭细胞数明显减少(P<0.05)，空白组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)。见图3。

图3 Transwell实验检测细胞的侵袭能力(苏木精染色，×200)

2.5细胞的迁移运动能力 转染组、对照组和空白组划痕愈合率分别为23.63%±1.47%、57.17%±3.86%、58.13%±2.35%；空白组和对照组差异无统计学意义(P>0.05)，转染组明显小于对照组及空白组(P<0.05)。

3 讨 论

骨肉瘤恶性程度高，好发于儿童及青少年，发生转移早，预后差，肿瘤新生微血管的形成和细胞外基质(ECM)的降解是骨肉瘤生长、侵袭、转移及复发等过程中的关键环节。基底膜和ECM是抵御和抑制肿瘤侵袭和转移的天然屏障。恶性肿瘤在局部侵袭和转移的过程中，癌细胞必须具备降解ECM和基底膜的生物学能力。MMPs是锌离子依赖蛋白水解酶，能降解ECM成分，与肿瘤浸润、转移、血管形成关系十分密切〔5〕。MMPs在肿瘤中呈高表达，在促进肿瘤的侵袭、转移中有重要作用。一方面通过激活和释放血管内皮生长因子而促进肿瘤血管的生成，另一方面通过降解ECM而降低微血管生成的压力〔6〕。MMP-9是MMPs家族成员之一，属于Ⅳ型胶原酶，MMP-9是消化降解Ⅳ型胶原最关键的酶，主要参与基质的降解和再塑，并且与间质血管关系密切，调控肿瘤的浸润和转移能力〔7〕。MMP-9通过直接或间接降解基底膜和ECM成分调节肿瘤细胞与基质的黏附，激活具有活性的酶等作用来促进肿瘤细胞的局部侵袭和远处转移〔8〕。MMP-9在多种恶性肿瘤呈高表达，且其表达水平与该肿瘤的血管生成、侵袭、转移及复发等密切相关〔9〕。研究表明，MMP-9在骨肉瘤组织中表达显著增高，而且其与骨肉瘤的恶性程度、局部浸润、远处转移及肿瘤复发有关〔4〕，是临床评价该病患者治疗效果的重要指标〔10〕。

骨肉瘤的侵袭、转移及肿瘤血管形成是一个多阶段、多基因参与的复杂过程。血管生成相关因子在骨肉瘤组织直径超过2 mm，新生微血管的形成过程中起着决定性作用。VEGF是目前作用最强、研究最清楚的一种多功能促进肿瘤的血管生长因子，通过与血管内皮细胞受体特异性结合，促进内皮细胞变异、运动、迁徙、增加血管通透性及血浆蛋白渗出等促进肿瘤血管生成作用。由于新生微血管基底膜缺损，通透性大，癌细胞易侵入血管，发生局部侵袭和远处转移。另外VEGF还可以通过增加ECM促进肿瘤血管形成，也可直接作用于血管内皮细胞，起到促进细胞分裂、改变细胞形态及迁移血管构建的作用〔11〕。李瑞玲〔12〕采用免疫组化检测发现骨肉瘤中MMP-9和VEGF的表达量明显高于良性骨肿瘤组织，并且与骨肉瘤临床分期和转移相关，说明骨肉瘤中MMP-9和VEGF表达明显上调，与骨肉瘤的发生发展及浸润、转移有关。

RNA干扰(RNAi)是最近几年新兴的基因沉默技术，是将shRNA或siRNA通过载体介导入细胞内，从而达到其发挥沉默基因的作用，由于shRNA比siRNA作用更高效、稳定，因此目前大部分被设计成shRNA。RNAi具有抑制率高，易筛选靶序列，效率高等特点，已应用于基因功能研究及肿瘤疾病的基因治疗等。

本研究说明转染成功。利用RNA干扰技术沉默MMP-9，通过作用于VEGF，可降低骨肉瘤MG-63细胞的侵袭和迁移能力。有研究设计合成针对MMP-9的siRNA利用脂质体转染胃腺癌细胞SGC7901发现靶向MMP-9的siRNA不仅能特异性降低MMP-9 mRNA及蛋白的表达，且能抑制胃腺癌细胞的侵袭和迁移〔13〕。胡娜等〔14〕利用siRNA干扰黑色素瘤高转移细胞B16F10的MMP-9和FAK双基因，发现可抑制小鼠黑色素瘤生长和在体迁移。Mei等〔15〕应用siRNA技术沉默骨肉瘤细胞VEGF发现细胞增殖与浸润明显受到抑制，王家琪等〔16〕将携带siRNA-VEGF的骨肉瘤细胞导入裸鼠体内，发现肿瘤微血管密度、体积及重量受到抑制。

利用RNA干扰技术沉默基因可调控骨恶性肿瘤的生长、侵袭转移、耐药性等，shRNA在骨肉瘤的基因靶向治疗中显示出良好的应用前景。然而，关于shRNA诱导基因沉默在恶性骨肿瘤中的研究比较局限，许多研究仍然处于基础探索研究阶段，如何与临床治疗相结合则需要进一步研究。随着对shRNA诱导基因沉默在骨肉瘤研究中的不断深入，shRNA诱导基因沉默有望成为骨肉瘤临床治疗的有效手段。