生物可降解镁合金的全身毒性试验

甘佼弘 马 晶 崔志琼 郭 振 张海娜 张美微 林 欣 王晔玲

(吉林大学第一医院心血管疾病诊疗中心，吉林 长春 130021)

镁是人体细胞内含量仅次于钾的必需微量元素之一，是所有金属材料中密度最接近人体骨密度的金属，具有理想的力学相容性；且镁合金表面带有负电荷，具有低血栓源性和良好的生物相容性〔1〕。其次，镁离子在人体中参与新陈代谢过程，能激活体内多种酶，参与体内蛋白质的合成、肌肉收缩及体温调节。最为重要的是镁合金具有优异的可降解性，可降解生物镁合金因具有良好的综合力学性能、生物活性等特征而被誉为最有发展前景的生物医用金属材料〔2〕。目前，生物可降解镁合金已作为骨固定材料、多孔骨修复材料、普外科植入支架、口腔科牙种植体材料、心血管可降解镁合金支架被广泛研究〔3〕。

经皮冠状动脉介入(PCI)是目前治疗冠心病的主要方法之一〔4〕。而目前临床上主要使用的金属支架，因其在体内长期留存不能降解，晚期会出现支架内血栓形成的风险，需要长期给予抗血小板治疗，并且能阻碍外科血运重建、侧支循环的形成及血管正性重塑的过程。此外，长期存留于体内的金属支架作为异物会削弱冠状动脉的磁共振成像(MRI)或是CT影像。因此，尽早研究出安全有效的生物可降解支架应用于临床冠脉病变的患者变得尤为迫切。根据目前研究，生物可降解镁合金具有良好的弹性形状记忆功能、物理机械性能及生物相容性〔5〕，同时具有降低支架内急性血栓形成、抑制内皮素的缩血管反应等作用。因此，生物可降解镁合金被认为是最有前景的用于心血管支架的金属合金材料〔6〕。本文采用的生物可降解镁合金是吉林大学工程仿生教育部重点实验室开发研制的，根据国际标准化组织(ISO)对医用植入材料的评价标准进行急性、慢性全身毒性试验，以探究该材料的安全性，为生物可降解镁合金支架的切割及临床安全应用提供科学依据。

1 材料和方法

1.1材料与仪器

1.1.1试验动物和材料、仪器 (1)Wistar大鼠(吉林大学实验动物中心)；(2)生物可降解镁合金Mg-5Sn-1Zn-0.5Ca合金(吉林大学工程仿生教育部重点实验室)；(3)高压灭菌机(韩国)；(4)CDULGER型血球计数仪(美国)；(5)Olympus2700型全自动生化分析仪(日本)。

1.1.2浸提液制备 将生物可降解镁合金数枚经清洗、高压灭菌、烘干后置于无菌培养瓶中，按照ISO文件要求，按试样表面积/浸体介质为3 cm2/ml的比例加入0.9%的无菌生理盐水，放置在37℃培养箱中72 h后，得到生物可降解镁合金浸提液，放入4℃冰箱保存备用。

1.2方法

1.2.1急性全身毒性试验 取40只清洁级Wistar大鼠，体重120～140 g，雌雄各半，试验期间给予标准实验室饮食，不予限量，随机分成试验组和对照组(各有10只雌性及10只雄性)，雌雄分笼喂养，记录每只大鼠的初始体重。按照50 ml/kg的剂量向试验组大鼠尾静脉注射生物可降解镁合金浸提液，注射速度不超过0.1 ml/s，予对照组大鼠注射等量生理盐水。注射后立即观察小鼠体内是否出现副作用，并于注射后4、24、48、72 h继续观察小鼠的进食、活动、死亡等一般情况，并记录体重变化。

1.2.2慢性全身毒性试验 取清洁级Wistar大鼠80只，体重60～80 g，雌雄各半，随机分成对照组和试验组(各有20只雌性及20只雄性)，记录每只大鼠的初始体重。试验组进行如下操作：(1)将大鼠以戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔注射麻醉后，背部脱毛、消毒，在背部皮下植入生物可降解镁合金薄片，常规缝合皮肤。(2)剪去胸部及颈部的鼠毛，然后固定于小手术台上，切开气管行气管插管连接动物呼吸机，设置呼吸频率为80次/min，潮气量5～8 ml，吸呼比1∶1，于胸部正中线偏左约1 cm平腋下缘作长约2 cm的纵向切口，钝性分离各层胸肌及肋间肌，于左侧第5、6肋间开胸，但不切断肋骨，将沾生理盐水的脱脂薄棉片压扁后置于心脏及左肺间，充分暴露心尖部，将准备好的生物可降解镁合金薄片插入心尖部心肌组织内，观察心脏节律稳定、无活动性出血后，逐层关闭胸腔。大鼠自然清醒后常规饲养，规律照明，自由进食及饮水。对照组给予同样的操作处理，但不植入任何材料，注意无菌操作及术后抗生素使用。植入期间每天观察大鼠的一般情况，每3 w称重一次。植入镁合金3个月和6个月后，每组动物分别取20只(雌雄各半)，采集大鼠血液作血生化及血液常规指标检测。分别将大鼠处死解剖，对各脏器称重并计算脏器指数，同时对对照组、植入6个月后大鼠心肌及骨骼肌进行组织病理学检查。取植入镁合金周围心肌组织及骨骼肌组织，置入10%中性甲醛固定24 h以上，经乙醇脱水、石蜡包埋成块后切片染色，在光镜下观察其组织病理学改变。

1.3统计学分析 使用SPSS22.0软件行t检验。

2 结 果

2.1急性全身毒性反应 对照组及试验组大鼠均一般情况良好，活动、进食正常，4、24、48、72 h内未观察到步态不稳、瘫痪、呕吐、大小便排泄不良、惊厥、呼吸困难、死亡等情况，体重呈增长趋势。证明生物可降解镁合金不引起大鼠急性全身毒性反应。

2.2慢性全身毒性反应

2.2.1一般情况 在6个月内，两组大鼠外观、一般状态、行为活动及饮食情况相同，两组雄性与雌性大鼠各时间内体重差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2.2血液常规检测 与对照组相比，试验组3个月和6个月后红细胞(RBC)、白细胞(WBC)、血红蛋白(Hb)、血小板(PLT)等血液常规指标差异无统计学意义(P>0.05)，谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、血糖(GLU)、总蛋白(TB)、白蛋白(ALB)、血肌酐(Crea)、尿素氮(BUN)等血生化指标差异也无统计学意义(P>0.05)。见表2，表3。

表1 生物可降解镁合金植入后不同时间对雄性、雌性大鼠体重的影响

表2 两组术后植入生物可降解镁合金3、6个月后RBC、Hb、WBC、PLT水平比较

表3 两组术后3、6个月ALT、AST、ALP、GLU、TP、ALB、BUN、Crea水平比较

2.2.3脏器系数结果 两组术后3个月和6个月心、肝、肺、肾、睾丸、前列腺、卵巢、子宫各脏器系数差异无统计学意义(P>0.05)。见表4。

2.2.4病理组织学检查 术后6个月，两组镜下均未见明显炎症细胞浸润，心肌组织、骨骼肌组织细胞形态基本正常。表明生物可降解镁合金植入动物体内无慢性全身毒性反应。见图1。

表4 两组术后3、6个月，心、肝、肺、肾、睾丸、前列腺、卵巢、子宫等脏器系数比较

图1 两组术后6个月心肌、骨骼肌组织病理组织学改变(HE，×200)

3 讨 论

自1977年Gruntzig〔7〕首次应用PCI治疗冠状动脉疾病后，PCI已逐渐成为治疗冠心病尤其是急性心肌梗死的主要手段。曾经使用的金属裸支架与目前广泛应用的药物涂层支架是以耐腐蚀金属为材料制成的永久性支架，病变血管在置入支架后需要6～12个月完成血管重构和内皮愈合〔8〕，而永久性支架在完成支撑作用后不能降解，容易出现血管内皮功能紊乱、局部慢性炎症、新生组织过度增生、晚期血栓形成等导致支架内再狭窄〔9,10〕。于是人们开始关注生物可降解支架(BDS)的发展应用。BDS在理论上完成使命支撑作用后会逐渐降解至消失，目前研究中的BDS主要包括可降解镁合金支架、生物可降解铁合金支架和可降解聚合物材料支架。然而聚合物材料X线下不显影，提供支撑力有限，变形能力差〔11〕；铁合金在生理环境中腐蚀速度慢，腐蚀产物容易阻塞血管，降解速度慢，故两者不适用于可降解血管支架〔12〕。因此，可降解镁合金已成为国内外近些年研究支架材料的新方向。

国内外已开展多项关于可降解镁合金支架的基础研究，如将可降解镁合金支架植入猪或兔的冠状动脉中，观察镁合金支架降解速率及对动脉内膜形成的长期影响，结果显示支架有良好的生物相容性、极低的血栓栓塞发生率和炎症反应〔13,14〕。临床上已逐渐开始应用可降解镁合金支架，如植入镁合金支架治疗下肢动脉严重缺血的患者及肺动脉闭锁或主动脉狭窄的新生儿，结果表明镁合金支架具有良好的支撑作用，无血液和血管方面的毒性反应，植入支架处的血管通畅，与普通支架相比抑制了平滑肌细胞增殖的同时加快了内皮化速度〔15,16〕，但支架降解速度过快，病变血管过早的失去支撑作用，容易造成负性重构导致再狭窄〔17〕。目前通过将包括铝、钙、锰、锌、硅、锂、锶、锆、钇和稀土元素(铈、镨、钕、钆、铱)等耐腐蚀的元素加入镁合金中，降低腐蚀速度，但其安全性及有效性尚未可知〔18〕。

本试验着重从生物可降解镁合金的急性全身毒性和慢性全身毒性方面进行了研究。实验结果提示此可降解镁合金无明显生物毒性，未见急性及慢性全身毒性反应，符合医学生物材料要求。但是，本实验对象为动物，与人体存在较大的差异，且仍需进一步验证其热原、细胞毒性、溶血、皮内反应、致敏反应、遗传毒性等。同时，镁合金的性能对生物可降解镁合金支架的加工成型技术来说至关重要。因此，将生物可降解镁合金作为心血管支架安全有效地应用于临床，还需进行大规模深入系统的研究。