心肌缺血小鼠牛磺酸代谢和保护作用的分子机制

张增雷 刘 星 胡 静 杜书迪 任凤云

(牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011)

心肌缺血会对机体心脏产生很多不良的后果，造成的直接后果是降低其心肌细胞有氧代谢功能，减少其产能，使心脏活动时所需的能量供应减少，甚至会产生心律失常及心力衰竭〔1,2〕。尽管目前临床上的再灌注手段可以在一定程度上缓解心肌缺血及顿抑心肌，但已经造成的损伤心肌的修复困难及缺血再灌注造成的新的心肌损伤导致再灌注治疗的部分病人依然产生心力衰竭和左心室重构〔3,4〕。因此在进行再灌注治疗之前采取心肌保护药物治疗可能会产生协同的效果〔5〕。牛磺酸(Taurine)属于一类β-氨基酸旳亚磺酸类似物，属于机体内含量最高的游离氨基酸〔6〕。牛磺酸对于机体的许多组织及细胞都存在一定程度的保护作用〔7,8〕。研究发现牛磺酸一般是通过抑制细胞凋亡、减少脂质过氧化损伤、稳定细胞膜、调控细胞渗透压、清除氧自由基及维护细胞内稳态等作用机制，从而产生保护缺血所引发的心肌损伤、避免动脉粥样硬化和调控血压的作用〔9,10〕。目前在心肌缺血的病理状态下，心肌细胞内牛磺酸的代谢和保护作用的分子机制的研究较少。本研究探讨牛磺酸对2型糖尿病大鼠缺血再灌注损伤心肌的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 健康雄性昆明种小鼠30只，体质量18～22 g，由中国实验动物中心提供(购于武汉医学科学院实验动物中心)。随机分为模型组(异丙肾上腺素2 mg· kg-1· d-1，ip.，西南药业股份有限公司)、正常对照组(生理盐水，10 ml·kg-1·d-1，ig.)、牛磺酸组(牛磺酸，400 mg· kg-1·d-1，ig.，苏州弘森药业有限公司)，每组10只。

1.2小鼠心肌缺血模型的建立 各组分别采取剂量(0.1 ml/10 g)灌胃预防给药，1次/d，连续1 w。第5天除正常对照组外，其余各组预防给药30 min后，腹腔注射0.02%的异丙肾上腺素(ISO)造模，正常对照组腹腔注射等量生理盐水，1次/d，连续3 d。末次给药后1 h，小鼠眼球采血处死，将血清分离待测。

1.3生化指标测定 造模12 h和3 d，小鼠眼球采血，取血2 ml到试管中，离心3 000 r/min 15 min后，提取上清液，对小鼠血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量进行测定。采用邻苯三酚比色法对SOD活性进行测定，采用硫代巴比妥比色法对MDA含量进行测定。

1.4心肌含水量(MWC)及心肌指数(MI)的测定 取血完成后，处死小鼠快速取出完整心脏，在冰的生理盐水中清洗淤血后，将大血管及结缔组织进行去除，采取滤纸将水分吸干后，称取其湿重。然后放到干燥箱中，在110℃下干烤8 h后，再称取其干重。MWC=(湿重-干重)/湿重×100%;MI=湿重/体重×100%。

1.5酶联免疫吸附试验(ELISA)检测小鼠白细胞介素(IL)-6、C反应蛋白(CRP)的水平 采取空白孔调零，酶标仪对450 nm处的OD值进行测定。以标准品OD值为横坐标，IL-6以浓度0.0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 ng/μl为纵坐标，CRP以浓度0、5、10、20、50、100 ng/μl为纵坐标。制作标准曲线采取软件Curve Expert1.3。根据样品的OD值采取Excel WPS计算相应浓度。

1.6Western印迹检测相关蛋白的表达 取液氮冻存好的小鼠心肌组织，将其研磨成粉末，充分裂解30 min后，在4℃的条件下进行15 000 r/min离心20 min，提取上清，根据聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)蛋白活性测定试剂盒(增强型)(碧云天生物技术研究所)对蛋白定量进行测定。将30 μg蛋白进行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，将电泳分离好的蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，室温条件下在5%脱脂牛奶中进行反应1 h，充分洗涤后分别添加一抗小鼠抗人胞TAUT单克隆抗体(1∶1 000)，兔抗鼠半胱氨酸双加氧酶(CDO)多克隆抗体(1∶1 000)及兔抗人半胱氨酸亚磺酸脱羧酶(CSD)单克隆抗体(1∶1 000)后，在4℃的条件下反应过夜，充分洗涤后添加二抗辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(1∶10 000)或者HRP标记的山羊抗小鼠IgG(1∶10 000)，在室温条件下反应30 min，充分洗涤后，采取电化学发光(ECL)反应1 min，采用全自动数码凝胶图像分析系统进行拍照观察。

1.7统计学分析 采用SPSS20.0统计软件进行单因素方差分析、LSD-t检验、χ2检验。

2 结 果

2.1各组血清SOD活性及MDA含量的比较 模型组、牛磺酸组与正常对照组比较，血清总SOD活性明显下降，MDA含量明显上升(P<0.05)。牛磺酸组与模型组相比，血清总SOD活性明显升高，MDA含量明显下降(P<0.05)。见表1。

表1 各组血清SOD活性及MDA含量的比较

与正常对照组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05；下表同

2.2各组心肌MWC比较 与正常对照组比较，模型组及牛磺酸组MWC明显增高(P<0.05)。与模型组比较，牛磺酸组MWC显著减少(P<0.05)，对模型组增加部分的抑制率达71.05%，见表2。

2.3各组MI比较 与正常对照组比较，模型组及牛磺酸组MI明显提升(P<0.05)。与模型组比较，牛磺酸组MI明显降低(P<0.05)，对模型组增加部分抑制率为75.29%，见表2。

表2 各组MWC、MI比较

2.4各组细胞因子IL-6、CRP比较 与正常对照组比较，模型组及牛磺酸组各时间段IL-6、CRP表达水平明显提升(P<0.05)。与模型组比较，牛磺酸组IL-6、CRP表达水平显著降低(P<0.05)，见表3和表4。

表3 各组细胞因子IL-6水平比较

表4 各组细胞因子CRP水平比较

2.5各组心肌组织TAUT、CDO和CSD表达比较 与正常对照组比较，模型组和牛磺酸组心肌组织TAUT的表达下调；与模型组比较，牛磺酸组心肌组织TAUT蛋白的表达上调。与正常对照组比较，模型组和牛磺酸组心肌组织CDO及CSD蛋白的表达上调；与模型组比较，牛磺酸组心肌组织CDO及CSD蛋白的表达下调，见图1。

图1 蛋白质印迹法检测心肌组织TAUT、CDO、CSD表达水平

3 讨 论

心肌缺血一般都会导致缺氧，缺氧直接导致心肌细胞有氧代谢功能降低〔11〕。大剂量ISO可引起心肌收缩力提升，心率加快，心肌耗氧显著高于供氧，从而引发心肌缺血〔12,13〕。目前研究认为ISO诱导的心肌损伤和心肌相对缺血缺氧、膜通透性变化、心肌细胞产生水肿及氧自由基损伤等具有不同程度的关系〔14〕。SOD属于一种自由基清除酶，其活性的高低反映机体清除自由基的能力，MDA属于脂质过氧化反应的关键终产物，对其含量进行测定能够间接反映机体中自由基水平和脂质过氧化反应程度〔15〕。

牛磺酸属于细胞保护剂，存在清除自由基及抗脂质过氧化的作用，能够缓解由于缺氧导致的心肌细胞坏死，对心肌缺血损伤具有较佳的保护作用〔16,17〕。本实验结果说明心肌缺血导致小鼠的心肌细胞膜结构受到损伤，心肌细胞产生水肿。牛磺酸有较佳的保护心肌细胞膜结构及改善心肌水肿的效果，牛磺酸可能通过提升心肌组织清除氧自由基能力，抑制心肌组织脂质过氧化物生成等作用机制来缓解心肌缺血损伤。

炎性细胞因子IL-6和CRP为十分常见的炎症细胞因子，对心功能障碍的发生发展具有关键作用。临床上一般将测定血清IL-6和CRP的水平作为评估心肌损伤病人病情严重程度的关键参考指标〔18,19〕。本实验说明牛磺酸能够明显降低炎性细胞因子IL-6及CRP的水平，从而缓解由于炎性介质介导的损伤，进而可能起到心肌保护效果。

TAUT一般存在于细胞膜上，TAUT对于保持细胞内牛磺酸的浓度具有十分关键的作用。在CDO的作用下，半胱氨酸能够产生半胱氨酸亚磺酸，而半胱氨酸亚磺酸在CSD和P5P旳作用下，产生连二亚硫酸，最终在连二亚硫酸脱氧酶的作用下产生牛磺酸〔20,21〕。CDO及CSD在牛磺酸的合成过程中具有十分关键的作用〔22〕。本文结果证实了在心肌缺血及缺氧的状况下，心肌细胞表面TAUT表达数量的下调抑制了牛磺酸向心肌细胞内的转运，牛磺酸能够提升了心肌细胞内TAUT蛋白的表达水平，促进TAUT从胞质入核，与TAUT基因上游启动子区的TonE结合，上调TAUT蛋白的表达，抑制了CDO和CSD蛋白的表达，从而导致牛磺酸向心肌细胞内的转运明显增加。

综上，牛磺酸对小鼠心肌缺血具有保护作用，其作用机制可能是提升氧自由基清除系统活性，减少脂质过氧化，上调TAUT的表达，下调CDO及CSD蛋白的表达，从而发挥其对心肌缺血的细胞保护作用。