藏药十八味诃子利尿丸对大鼠局灶性脑缺血/再灌注损伤的保护作用

梁沛余 段路路 吴 穹

(青海大学医学院，青海 西宁 810001)

十八味诃子利尿丸，藏药名为金尼阿如久杰日布，处方源自《藏医医诀补遗》，收录于《卫生部药品标准·藏药》(编号：WS3-BC-0182-95)，是由诃子、余甘子、姜黄、金礞石等十八味药材经研磨、过筛、泛丸、干燥等藏医传统制药工艺炮制而成的复方制剂，有利尿、降糖等功效〔1〕，其构成药材中，红花、小檗皮、蒺藜、余甘子、姜黄、熊胆、牛黄、巴夏嘎等八种药材现已有科学研究〔2〕证实对脑缺血损伤有一定的保护作用，其余药材如诃子、刺柏等亦有抗氧化效能的报道，但此药目前在临床上主要应用于肾病、糖尿病等症，科学研究方面亦仅有在成分质量分析、抗菌效能等〔3〕领域的数篇报道，尚无对脑缺血损伤的药效学及机制的研究。本实验拟观测十八味诃子利尿丸预处理对模型大鼠多项指标的影响，证实十八味诃子利尿丸有对抗脑缺血/再灌注损伤的作用并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1动物及分组 SD大鼠80只，雄性，质量(260±20)g，清洁级，购自兰州大学实验动物中心，批号：SCXK(甘)2009-0004，于青海大学医学院SPF 级动物房内饲养。动物随机等量分为藏药组、西药组、模型组及假手术组。

1.2药品与试剂、仪器 十八味诃子利尿丸(青海省格拉丹东药业有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒(南京建成生物工程研究所)；2，3，5-氯化三苯基四氮唑(TTC，Sigma公司)；其他试剂均由青海大学医学院机能实验室提供。BP110S型电子天平(德国Sartorius公司)；离心机(美国Beckman公司)；721型分光光度计(上海精密仪器有限公司)。

1.3方法

1.3.1预处理 藏药组给予十八味诃子利尿丸(300 mg·kg-1·d-1)干预，西药组给予尼莫地平(10.8 mg·kg-1·d-1)干预，模型组与假手术组均给予等量0.9% NaCl溶液干预，连续灌胃给药10 d。

1.3.2造模 末次给药2 h后，应用加长栓线的新式Zea Longa线栓法建立大脑中动脉闭塞再灌大鼠模型〔4〕。大鼠全麻(水合氯醛腹腔注射)后固定，颈部于正中位做3 cm切口，小心剥离右侧颈内动脉(ICA)、颈外动脉(ECA)和颈总动脉(CCA)，行CCA、ECA结扎。夹闭ICA，在ICA与ECA呈“Y”形分叉处剪切口，将加长线栓(60 mm，常规为40 mm)插入并开放ICA，调整栓线角度，缓慢推入颅内，直至有明显阻力后停止推进。假手术组除栓线不推入ICA外，其余操作与其他三组完全一致。记录栓线入颅时间，2 h后拔出栓线实现再灌注。

1.4指标测定

1.4.1行为学测定 缺血2 h再灌注2、12、24 h后按照Bederson等〔5〕建立的5分评分法对各组大鼠神经功能缺陷评分。

1.4.2脑含水量测定〔6，7〕缺血2 h再灌注24 h后，各组随机取6只大鼠冰盘上断头取脑，计算脑组织含水量百分比。

1.4.3脑梗死灶面积〔8，9〕测定及海马CA1区组织病理学观察 缺血2 h再灌注24 h后，各组随机取6只大鼠冰盘上断头取脑，冠状位切成5片，取第1、2、3、5脑片行TTC染色，计算脑梗死灶面积百分比；取第4脑片行硫堇染色，观察海马CA1区组织病理学变化，计数存活神经元。

1.4.4脑组织SOD活性及MDA含量的观测 缺血2 h再灌注24 h后，各组取余下8只大鼠，冰盘上取右侧脑组织，匀浆，离心，取上清液按说明书测定脑组织中SOD活性及MDA含量。

1.5统计学方法 应用SPSS19.0软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1各组大鼠不同灌注时间神经功能缺陷评分比较 在不同灌注时间，与假手术组比较，模型组神经功能缺陷评分均明显升高(均P<0.05)，十八味诃子利尿丸及西药尼莫地平均可降低此效应(均P<0.05)，见表1。

2.2各组脑组织含水量及梗死灶面积比较 与假手术组比较，模型组脑组织发生水肿、梗死(均P<0.05)；十八味诃子利尿丸预处理及西药尼莫地平均可显著减轻脑组织梗死程度(P<0.05)，可缓解脑组织水肿，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

2.3各组海马CA1区组织病理学观测结果比较 见图1，与假手术组〔(89.83±11.60)个/视野〕比较模型组海马CA1区神经元胞体结构被破坏，神经元发生固缩坏死，存活神经元数量明显下降〔(39.00±9.63)个/视野，P<0.05〕；十八味诃子利尿丸预处理和西药尼莫地平组均可减轻建模损害，对抗神经元胞体损伤，增加神经元的存活量〔(59.67±8.55)个/视野，P<0.05〕。

表1 不同灌注时间神经功能缺陷评分比较(分，

与假手术组比较：1)P<0.05；与模型组比较：2)P<0.05，下表同

表2 各组脑组织含水量、梗死灶面积比较

图1 各组海马CA1区组织病理学比较(硫堇染色，×200)

2.4各组脑组织SOD活性及MDA含量比较 如表3所示，与假手术组比较，模型组脑组织SOD活力降低，MDA的生成增加(均P<0.05)，致使神经元损伤；十八味诃子利尿丸预处理及西药组均可提高脑组织抗氧化能力(均P<0.05)，减轻自由基损害。

表3 各组脑组织SOD活性、MDA含量比较

3 讨 论

脑缺血/再灌注损伤过程涉及多种复杂机制，可诱导神经元发生凋亡〔10〕、坏死、自噬等病理生理改变，最终对脑功能造成不可逆损伤。氧化应激与脑缺血/再灌注损伤关系密切〔11〕，干预氧化应激〔12〕阻止病程进展已成为该研究领域的热点之一。脑缺血/再灌注损伤过程中，磷脂酶A2活化，大量自由基生成，且脑SOD活力水平处于低值状态，不能对其进行有效的清除，最终造成自由基积聚及MDA生成增加。自由基可致血管反应性改变，损伤血脑屏障与血管内皮细胞，还可致膜上的磷脂被降解，失去其原有生物学功能，促使神经元固缩凋亡，这与自由基可在膜上发生过氧化反应关系紧密。

自由基可诱导神经元凋亡，其过程与caspase、Bcl等蛋白家族关系密切。目前认为自由基诱导凋亡的主要途径有：①内质网途径：脑缺血/再灌注损伤可活化神经元胞内众多酶类，诱发内质网发生未折叠蛋白反应，脑损伤生成的大量自由基亦参与到此过程中。在众多因子的作用下，内质网处于持续应激状态，调控caspase等凋亡蛋白家族的表达，促使神经元凋亡。②线粒体途径:脑缺血/再灌注损伤时，线粒体呈现应激状态，大量自由基由此产生，造成线粒体蛋白翻译改变、内切酶被活化、多种水解酶被激活，致使细胞色素C氧化酶处于低水平，从而介导caspase等凋亡蛋白家族的活化，诱导神经元凋亡。此外，自由基提升线粒体DNA突变率及对呼吸链的直接攻击亦是影响凋亡的重要原因。③死亡受体通路:脑缺血/再灌注损伤时，自由基可通过调节NF-κB、Fas/FasL等〔13〕通路，促进神经元的凋亡。因此，提高SOD活力水平〔14〕，防止自由基集聚，减少MDA在氧化应激下的生成，寻找干预氧化应激的新药物，对阻止脑缺血/再灌注损伤进程意义重大。

十八味诃子利尿丸为传统藏药制剂，其构成药材中的八种以上现已有科学研究证实对脑缺血损伤有一定的保护作用，其余药材如诃子、刺柏等亦有抗氧化效能的报道。本实验研究发现，十八味诃子利尿丸预处理可降低脑缺血/再灌注损伤大鼠神经功能缺陷评分、梗死灶面积，减轻神经元变性，增加神经元存活数量，证实十八味诃子利尿丸可对抗脑缺血/再灌注损伤；十八味诃子利尿丸预处理可使大鼠脑组织中SOD活性水平提高，MDA生成下降，防止自由基积聚，削减自由基对脑组织的负性作用，说明其对脑缺血/再灌注损伤的保护机制与提高机体抗氧化能力关系密切。但由于脑缺血/再灌注损伤机制极为复杂，故其保护效能的具体机制仍需进一步探索。