SIRT1基因多态性与海南省长寿人群的相关性

陈小萍 甯超学 姚 尧 朱 乔 曾 倩 邢文婷 王梦芸 赵亚力 栾复新

(中国人民解放军总医院海南分院中心实验室，海南 三亚 572014)

阐释寿命调控机制，实现延缓衰老、延长寿命一直以来是人们关注的焦点和自然科学研究的热点。衰老的分子机制也揭示物种的寿命在一定程度上受遗传因素控制，在线虫中借助基因的突变即可抑制生命进程中的衰退性改变，从而延长寿命〔1〕。人类基因组单体型图(HapMap)构建了不同人群的高密度SNP图谱，为我们解释复杂疾病的遗传因素，建立特定疾病风险与SNPs之间的联系创造了条件〔2〕。沉默信息调节因子(sir)2相关酶类(SIRT)是一种依赖NAD+的去乙酞化酶类，包括SIRT1～7共7个成员，其中以SIRT1的研究最详尽。SIRT1通过组蛋白/非组蛋白去乙酰化基作用影响基因的转录，在抵抗应激，调节细胞凋亡和能量代谢方面发挥重要作用〔3〕。百岁老人作为人类健康长寿的主要象征，其肿瘤、糖尿病、免疫系统疾病的发病率低于普通人群〔4，5〕，针对百岁老人和普通人群的对比调查将有助于发现影响人类衰老和寿命的关键因素。截至2013年海南省存活百岁老人1 944人，每十万人中有百岁老人21.46人，因此在2014年海南岛被国际老龄化长寿专家委员会授予“世界长寿岛”称号〔6〕。有研究证实SIRT1与多个地区人群长寿和复杂性疾病相关〔7〕，但目前对于海南长寿人群SIRT1基因研究尚未见有报道，因此我们对SIRT1基因多态性与海南省长寿人群的相关性进行分析。

1 对象与方法

1.1研究对象 由中国人民解放军总医院海南分院多科室组成的调研团队在2014～2015年间入户调查世居海南省长寿老人，从调研的老人中随机抽取36例(长寿组)，男19例，女17例，年龄100～108〔平均(102.78±1.93)〕岁。长寿组对象均接受问诊及体格检查，其认知、自理能力及常规体检均基本正常，无患肿瘤、免疫系统疾病、结缔组织病、糖尿病、心脑血管病变等器质性病变，属于健康或基本健康者。长寿组均由本人或亲属签署知情同意书后，采静脉血3 ml，EDTANa2抗凝-80℃保存。为避免环境因素造成的差异，对照组选取标准为与长寿老人无亲缘关系健康人群。对照组来自中国人民解放军总医院海南分院健康体检中心体检对象，共计39例，男24例，女15例，年龄40～65〔平均(46.92±5.25)〕岁。对照组均进行问诊和体格检查，其认知、自理能力及常规体检均正常。对照组均从检验科采静脉血2 ml，EDTANa2抗凝-80℃保存。

1.2方法

1.2.1基因组DNA的提取 取EDTANa2抗凝的受试者静脉血0.2 ml，用全基因组DNA提取试剂盒抽提DNA，通过核酸定量仪测定DNA进行浓度和纯度，-20℃保存。全基因组DNA提取试剂盒(货号：51104)购自QIAGEN公司；EON核酸定量测定仪购自美国BIO-TEK公司。

1.2.2分型SNP的选择 从HapMap数据库(http：//hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/cgi-perl/gbrowse/hapmap3r2_B36/#search)中搜索人类SIRT1基因，确定SIRT1基因位于染色体10q21.3，用Haploview4.2软件下载CHB(中国汉族北京)人群SIRT1基因上下游10 kb范围内SNP位点及分型结果数据，设置最小等位基因频率(MAF)>0.05，连锁不平衡参数D'=1，r 2>0.8筛选SIRTI基因的Tag SNP，获取21个SNP。根据连锁不平衡分析选定检测rs3740051、rs4746720、rs10997870位点，同时补充第6外显子区非同义突变rs2273773和汉族人群长寿显著相关的rs3758391位点，SNP位点信息见表1。

表1 中国汉族人群SNP位点信息

1.2.3PCR反应 PCR扩增反应引物序列及退火温度见表2，PCR反应体系30 μl，包括：10倍缓冲液3 μl，dNTP 2 μl，正义链引物1 μl，反义链引物1 μl，rTaq酶0.2 μl，模板DNA 2 μl，H2O 20.8 μl。PCR反应条件为：96℃ 5 min，(96℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s)×30个循环，72℃ 10 min。PEppTC-200 PCR扩增仪购自BIO-RAD公司，TaqDNA聚合酶和dNTP购自Takara公司。

表2 PCR扩增引物与退火温度

1.2.4PCR产物纯化 按照Millipore公司96纯化板操作流程操作：向96纯化板孔中加入100 μl ddH2O，取出PCR产物至96纯化板中室温静置10 min，真空抽滤泵抽 10 min至抽干，向纯化板中加入40 μl ddH2O，室温溶解10 min，取出对应的孔中的纯化产物至另一96孔PCR板中。

1.2.5PCR产物测序 测序引物序列及退火温度见表3，测序反应体系为：2 μl混合物(Bigdye3.1、5倍序列缓冲液、 H2O)，2 μl纯化PCR产物，1 μl引物(5 mmol/L)。测序反应程序为：循环条件为：95℃ 15 s(95℃ 15 s，50℃ 5 s，60℃ 90 s)×35个循环，终止反应。ABI 3730XL型DNA测序仪购自Applied Biosystems公司，引物合成和基因测序均由北京六合华大基因科技有限公司完成。

1.3统计学方法 采用SPSS19.0统计软件分析，运用Hardy-Weinberg(HW)平衡检验检测样本的群体代表性。用比数比值及其95%置信区间(95%CI)来评价相对风险。数据组间比较采用t检验，组间基因型频率及等位基因频率比较采用Fisher或Pearson检验。

表3 测序引物与退火温度

2 结 果

2.1HW平衡检验 长寿组和对照组的基因型和等位基因频率的分布(见表4)，rs3758391、rs3740051、rs2273773、rs4746720、rs10997870均符合HW平衡(P>0.05)，故均对其基因型和等位基因频率进行分析。

表4 SIRT1基因五个多态性位点HW平衡检验

2.2SIRT1基因5个SNP位点基因型与等位基因频率 见表5。rs3758391、rs3740051、rs2273773、rs4746720和rs10997870位点的基因型频率和等位基因频率在长寿组和对照组间分布差异均无统计学意义(P>0.05)。

表5 SIRT1基因5个SNP位点基因型与等位基因频率在长寿组和对照组中的分布〔n(%)〕

3 讨 论

人类SIRT1基因位于染色体10q21.3，有9个外显子，基因组序列约为33 kb，编码747个氨基酸，相对分子量约120 kD。SIRT1通过NAD+与AMP蛋白激酶(AMPK)相互调节活性，维持细胞内的能量平衡〔8〕。在热量限制(CR)条件下，细胞内NAD+增加，从而活化SIRT1蛋白延长寿命。白藜芦醇(Res)可激活SIRT1蛋白并发挥模拟CR的作用，降低氧化应激和炎症反应，延长复制性寿命〔9，10〕。

据报道SIRT1 rs4746720多态性与广西永福长寿人群存在关联〔11〕；rs4746720位点CC基因型可能为沈阳汉族人群衰老的危险因素，其遗传易感性主要来自于等位基因C，而rs3758391位点和沈阳汉族健康人群衰老没有关联〔12〕。SIRT1基因多态性与复杂疾病之间也存在紧密关联，SIRT1 rs4746720 CC+TT基因型存在更高的2型糖尿病发生概率〔13〕；rs4746720，rs3740051，rs1885472 位点H3(A-C-T)可能是2型糖尿病的危险因素〔14〕；rs4746720位点 CC突变基因型与老年垂体瘤患者的心理焦虑状态存在关联，可能促进焦虑的发生〔15〕。本研究以海南岛百岁老人为研究对象，发现rs3758391、rs3740051、rs2273773、rs4746720和rs10997870等5个位点的基因型频率和等位基因频率在长寿组和对照组间分布均无显著差异。本研究结果显示海南地区长寿人群与SIRT1基因多态性在统计学上无显著性差异。但通过分析SIRT1基因10 kb区域内SNP位点的连锁不平衡性，检测包含该区域内的所有常见SNP的5个标签SNP，明显提高了研究效率。如果在此基础上加大样本量，同时比较多种复杂性疾病与SIRT1 基因型频率之间的关系，对于解读海南独特条件下的长寿遗传因素会有新的发现。