甲状腺癌患者癌组织中CD34、增殖细胞核抗原和内皮细胞特异分子-1的表达及意义

李 锐 李晓丽

(吉林省人民医院病理科，吉林 长春 130021)

甲状腺癌近年来发病率逐年上升，其发病因素及发病机制成为当今医学界的研究热点〔1〕。肿瘤的发生、发展、预后、转移可能与多种癌基因、抑癌基因有关，也可能与多种炎性因子相关，因此肿瘤发病机制是一种多因素的生物学行为〔2,3〕。本实验通过检测CD34、增殖细胞核抗原(PCNA)、内皮细胞特异分子(ESM)-1在甲状腺癌组织、甲状腺癌旁正常组织中的蛋白含量、mRNA水平及蛋白阳性表达强度，探究其与甲状腺癌预后及转移的关系，为甲状腺癌的靶向治疗提供新的靶点。

1 资料与方法

1.1临床资料和实验分组 选取2016～2018年吉林省人民医院病理科确诊住院手术甲状腺癌患者作为研究对象，实验分为两组：甲状腺癌组织81例，男36例，平均年龄(56.3±2.1)岁，女45例，平均年龄(58.2±2.6)岁；甲状腺癌旁正常组织28例，男10例，平均年龄(56.9±2.7)岁，女18例，平均年龄(58.3±2.9)岁。甲状腺癌依据临床分期，Ⅰ～Ⅱ期56例、Ⅲ～Ⅳ期25例；依据病理分型，高分化31例、中分化36例、低分化14例；有淋巴结转移19例、无淋巴结转移62例。所有研究对象无其他脏器的病变，具有可比性(P>0.05)。

1.2实验仪器和试剂 烘干烤箱(上海仪器设备厂)，莱卡切片机(德国，Leica2245)，包埋机和捞片机(德国，Leica2245)，移液器(芬兰)，OLYMPUS BX51光学显微镜(日本OLYMPUS 公司)，7300型实时荧光定量PCR仪、Epoch酶标仪(美国ABI公司)。兔抗CD34、PCNA、ESM-1抗体由北京鼎国生物有限公司提供；SP9710和二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒由福州迈新生物有限公司提供；图像分析软件由厦门Motic公司提供。Trizol、反转录试剂盒、实时荧光定量试剂盒购于塔克拉公司；CD34、PCNA、ESM-1酶联免疫试剂盒购于长春鼎国生物有限公司。

1.3检测指标 取术后甲状腺癌组织和甲状腺癌旁正常组织，一部分冻存待测，一部分固定于10%的甲醛液中24 h，进行修块、脱水、浸蜡、包埋。

1.3.1CD34、PCNA、ESM-1蛋白阳性表达强度的检测 组织切片成3 μm，每个样本3片，80℃烤箱烘烤3 h，常规脱蜡至水，采用柠檬酸抗原修复液煮沸10 min进行抗原修复，分别滴加CD34、PCNA、ESM-1抗体(1∶300稀释比例)，进行CD34、PCNA、ESM-1免疫组织化学染色，DAB显色，操作严格依据SP试剂盒说明书。

1.3.2CD34、PCNA、ESM-1蛋白含量的检测 准确称取组织重量，按重量(g)∶体积(ml)=1∶9的比例，加入9倍体积的生理盐水，冰浴中研磨组织制备匀浆，2 500 r/min离心10 min，取上清液待测，操作严格依据酶联免疫试剂盒说明书进行。

1.3.3两组样本中CD34、PCNA、ESM-1 mRNA水平的检测 引物的设计和合成由上海生物工程有限公司提供，Trizol提取总RNA然后行实时荧光定量PCR(RT-PCR)，每个样本基因扩增3次取样本均值，采用2-ΔΔCt表示目的基因相对表达水平。

1.4统计学分析 采用SPSS16.0软件行t、χ2检验。

2 结 果

2.1CD34、PCNA、ESM-1在甲状腺癌、甲状腺癌旁正常组织中蛋白阳性表达强度、蛋白含量及mRNA水平的比较 与甲状腺癌旁正常组织比较，CD34、PCNA、ESM-1在甲状腺癌组织中的蛋白阳性表达强度均明显增强，蛋白含量及mRNA水平明显增高，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1、图1。

2.2CD34、PCNA、ESM-1在甲状腺癌中的阳性表达率与甲状腺癌临床病理特征的关系 CD34、PCNA、ESM-1在甲状腺癌组织中的阳性表达率随甲状腺癌临床分期逐级递增，随病理分级高、中、低分化依次递增，随无、有淋巴结转移依次递增，且差异均有统计学意义(均P<0.05)，见表2。

表1 CD34、PCNA、ESM-1在甲状腺癌、癌旁正常组织中蛋白阳性表达强度、蛋白含量及mRNA水平的比较

与癌旁正常组织比较：1)P<0.05

临床特征nCD34+-阳性率(%)PCNA+ -阳性率(%)ESM-1+-阳性率(%)临床分期 Ⅰ～Ⅱ563422 60.71 35 2162.5031 25 55.36 Ⅲ～Ⅳ25214 84.001) 22 3 88.001)20 580.001)病理分级 高分化311615 51.61 17 14 54.8314 1745.16 中分化362610 72.222)26 10 72.222)25 1169.442) 低分化1413 192.863)140100.003)12 2 85.713)淋巴结转移 无 623824 61.2938 2461.2935 27 56.45 有 1917289.474)19 0 100.004)16 384.214)

与Ⅰ～Ⅱ 期比较：1)P<0.05；与高分化比较：2)P<0.05;与中分化比较：3)P<0.05；与无淋巴结转移比较：4)P<0.05

3 讨 论

甲状腺癌是发病率增速最快的肿瘤之一，同时它也是内分泌系统最常见的肿瘤〔3〕。由于甲状腺癌的发病率增速快及复发率高，对甲状腺癌患者术后提供相应的靶向治疗尤为重要，以便对预后给予准确预判，提高患者的生存率及生存质量。

以往研究〔4,5〕多从与甲状腺肿瘤相关的多种癌基因、抑癌基因及炎性因子着手，本实验侧重于肿瘤内的微血管、内皮细胞因子及增殖细胞核抗原的研究，观察血液供应与甲状腺肿瘤发生、发展、浸润及转移的相关性。

CD34(人类造血干细胞抗原)起源于间质，是高原糖基化的跨膜糖蛋白，是血管内皮分化的标志物，特异度较高，能通过微血管密度反映肿瘤微血管的生成状况〔6,7〕。PCNA存在于细胞核内且在细胞核内合成，细胞周期中反映DNA的复制、合成状态，因此仅在增殖细胞的细胞核中表达，是判断肿瘤细胞增殖状态的标志物及良好指标〔8,9〕。

ESM-1主要表达于血管内皮细胞，是一种可溶性的糖蛋白，在许多恶性肿瘤中都呈高表达状态，与肿瘤的侵袭、转移、预后密切相关，其表达受多种因素调控，是肿瘤内皮组织血管侵袭的标志物〔10,11〕。

综上所述，CD34、PCNA、ESM-1在甲状腺癌组织的高表达反映了癌组织血液供应的丰富，提示甲状腺癌患者术后进行CD34、PCNA、ESM-1联合检测，有助于判断癌症患者的预后、转移，并开展针对性的靶向治疗。