液基细胞制片联合巴氏染色观察实体瘤脑膜转移患者脑脊液中肿瘤细胞形态学特点

庞晓川 李 琳 王永香 潘振宇

(吉林大学第一医院检验科，吉林 长春 130021)

脑膜转移也称脑膜癌病或癌性脑膜炎，指肿瘤细胞侵入蛛网膜下腔脑脊液中，弥漫浸润软脑膜或蛛网膜(柔脑膜)〔1〕。实体瘤脑膜转移既往被认为是一种罕见的致死性并发症。随着恶性肿瘤治疗效果改善，患者生存期延长，包括脑膜转移在内的远地转移发生率随之增加。全身化疗药物广泛应用，使中枢神经系统成为肿瘤细胞最终的避风港。近年来，脑膜转移的发生率明显上升。由于本病造成中枢神经系统弥漫受累，症状复杂多样，影像学检查缺少特异性，诊断困难。脑脊液细胞学检查找到恶性细胞是脑膜转移诊断的特异性标准〔1〕。由于既往诊断的病例数有限，且传统细胞学检查技术对细胞形态结构显示欠佳，细胞学检查往往被用于良恶性的判定〔2〕，而脑膜转移患者原发肿瘤的病理类型仍主要依靠组织学检查。目前认为，约有10%的脑膜转移患者既往无肿瘤病史〔1〕。近年来，常见以脑膜转移起病，原发灶隐匿或难以判定的患者〔3～5〕。

采用免疫化学法定性细胞来源的方法往往需要联合多种免疫标记物。然而，不同于胸腹水标本，脑脊液取材标本量有限，难以保存；绝大部分标本缺少足够细胞数量以离心出细胞球，进行固定包埋。这使得免疫细胞化学法检测脑脊液中肿瘤来源及类型的应用受限，并不被广泛应用〔6,7〕。另外，早有研究发现，脑脊液免疫细胞化学法较常规细胞学方法未能增加检查的敏感性，不作为脑膜转移诊断的推荐检测项目〔7～9〕。目前，基于细胞形态学的细胞学检查仍是实体瘤脑膜转移的主要细胞学检查方法。

液基细胞学技术是细胞病理学技术的重大进展，其采用流体力学原理及高精密过滤膜进行细胞采集，电化学技术使细胞向玻片上自然吸附，不仅可充分收集标本中的细胞成分，且对细胞无明显挤压等外力作用。整个制片及固定过程均保持了原有液态环境，降低细胞暴露于空气发生退变、损伤的概率。既往研究认为〔10～12〕，此方法适用于恶性实体肿瘤脑膜转移患者脑脊液细胞学检查，且利于肿瘤细胞形态学观察与分析。本文通过观察采用此技术进行脑脊液细胞学检查阳性的标本，总结不同病理类型肿瘤细胞形态特征表现，希望对提高脑脊液肿瘤细胞诊断水平有所帮助。

1 材料与方法

1.1研究对象 回顾吉林大学第一医院2009年9月至2014年5月收治的采用液基细胞制片联合巴氏染色的脑脊液细胞学检查方法获得细胞学诊断的恶性肿瘤脑膜转移患者。排除神经源性及血液系统来源恶性肿瘤，排除原发灶来源诊断不明患者，共81例患者入组。女42例，男39例，年龄37～ 72岁(中位年龄54岁)。其中，68例患者既往有恶性肿瘤史，包括肺腺癌29例、肺鳞癌1例、肺小细胞癌14例、肺大细胞癌1例、乳腺癌17例、胃腺癌3例、乳腺及肺双重癌1例，肝细胞癌1例，喉鳞癌1例；其余13例以脑膜转移为首发，进一步检查诊断肺腺癌9例，胃黏液腺癌2例，肺小细胞癌1例，原发颅内恶性黑色素瘤1例。除原发中枢恶性黑色素瘤外，其余患者均有组织学病理检查证实。按照细胞病理类型分为6类，腺癌60例、鳞癌2例、小细胞癌16例、大细胞癌1例、肝细胞癌1例、恶性黑色素瘤1例。

1.2脑脊液细胞学检查 全部脑脊液标本来源于患者治疗前的腰穿术，检查次数为1～4次，单次采集标本量6～12 ml。采集后需立即送检，尽早进行标本制片处理。

采用液基制片联合巴氏染色的细胞学检查方法：标本采集后加入10 ml PreservCyt细胞保存液混合，静置15 min以上；使用新柏氏2000液基细胞自动制片机制片；95%乙醇固定15 min；常规巴氏染色。

1.3阅片，总结及分析细胞形态学特征 所有标本由3名细胞病理专业医生镜下阅片。根据患者组织学检查确定的肿瘤病理类型进行分类，总结分析不同类型的细胞形态学特征表现，主要包括细胞一般形态及分布、胞质、核、染色质、核仁及细胞内特殊结构的表现特点。

2 结 果

显微镜下观察细胞形态结构(图1)，90%以上标本制片染色效果满意，杂质少，细胞退变少，可以清楚观察细胞形态。总结分析不同类型恶性细胞的形态特点(表1)，腺癌细胞：细胞体积明显增大，多呈圆形或椭圆形，散在或团簇分布；胞质深染，部分含有空泡；单核或多核，核质比多明显增大，也可较小，居中或偏位；染色质多为不均匀团片状深染，部分有细颗粒感；多有红染或蓝黑深染核仁，大小不一，数目不定；偶可见病理性核分裂象、胞质桥、细胞吞噬等表现。鳞癌细胞：体积较大，圆形或不规则形，散在或团簇分布；部分角化胞质为粉红色，伴细胞核缩小；多单核，核质比明显增大；染色质呈棉絮或颗粒样深染；大部分细胞核内具有多个红染核仁，多位于细胞核周边。小细胞癌：多团簇分布，细胞体积相对其他肿瘤细胞较小；单核，核质比极大，似裸核；染色质粗颗粒样深染；未见明确核仁。大细胞癌：散在或小簇分布，体积大，边界欠清；多单核；染色质粗颗粒样深染；未见明显核仁。肝细胞癌：散在分布，体积大，形态规整，边界清楚；胞质均匀深染，部分胞质中可见点状颗粒结构；染色质均匀深染，缺少颗粒感；大部分细胞核内可见单一圆形鲜红色核仁，体积大，多位于细胞核中央。恶性黑色素瘤：体积大，圆形，散在或小簇分布；胞膜有环周的伪足样突起；单核；核中央可见单一红色核仁，边界不清，体积较大；核或胞质中可见大小不等黑色块状物质。

表1 脑脊液中不同类型肿瘤细胞显微镜下特点

续表1 脑脊液中不同类型肿瘤细胞显微镜下特点

A～H：腺癌；I、J：鳞癌；K：小细胞癌；L、M：大细胞癌；N、O：肝细胞癌；P：恶性黑色瘤图1 脑脊液细胞学检查(液基制片，巴氏染色，× 400)

3 讨 论

正常脑脊液细胞成分相对简单，肿瘤细胞的形态特点明显区别于淋巴细胞、单核细胞等固有的细胞成分。因此，脑脊液细胞学检查对于非血液系统恶性肿瘤细胞的定性具有高度特异性〔2,6〕。恶性细胞的判定主要依靠细胞形态区别于脑脊液中正常细胞，并具有显著恶性特征。目前被广泛认可的细胞恶性形态学特征包括〔13〕：明显超过正常脑脊液细胞体积的异常大细胞；异常细胞间大小不一，多形性；细胞深染；核质比增大；多核、核不规则或有角状突起；核染色质深染、染色不均；多核仁；病理性核分裂象、胞质桥等。既往的细胞学检查方法，可以观察到以上恶性特征，并进行定性诊断，但多难以清楚观察到更加细致的形态结构，无法进行细胞分类〔6,14〕。

进一步研究发现〔13,15,16〕，脑脊液标本采集量少(<10.5 ml)，采集后未能及时制片处理(>90 min)，以及标本制片固定的过程中细胞暴露于空气中时间较长，是造成细胞退变、形态破坏、难以观察的主要因素。采用液基细胞制片技术的细胞学检查方法，可在技术上改善脑脊液中肿瘤细胞的保护，减少空气暴露，减少细胞退变，提高检出率〔12〕。本研究认为，液基细胞学技术在脑脊液肿瘤细胞的形态学观察方面具有明显优势。肿瘤细胞形态结构的清晰显示，不仅帮助细胞性质的判定，并能针对不同病理类型肿瘤细胞进行特征性表现的分析总结，使我们能够对脑脊液肿瘤细胞的病理类型进行判断。

巴氏染色法早已被发现在宫颈癌、泌尿系统肿瘤等上皮来源恶性肿瘤的细胞学检查染色中具有明显优势〔17〕。实体肿瘤中以上皮来源恶性肿瘤为主，其脑脊液标本的肿瘤细胞染色适合采用巴氏染色法。本组标本中，巴氏染色多将肿瘤细胞胞质染为蓝色或蓝绿色，核染色质染为蓝紫色或蓝黑色，核仁多为红色。胞质、核染色质及核仁等不同细胞结构间颜色对比鲜明，便于观察。液基细胞制片联合巴氏染色充分集合了细胞保护与形态结构颜色鲜明的特点，良好显示了细胞原有特征。染色质及核仁的显示细腻、清晰，是此方法的重要优势。

不同病理类型的肿瘤细胞具有不同的形态特征，这些特征主要表现在细胞核、染色质、核仁等细胞结构上的差异。脑膜转移最多见的细胞类型为腺癌，其结构形态最为多样，缺乏特征性，可能是由于原发肿瘤来源于多种不同器官所致。腺癌细胞核染色质多为不均匀团片状深染，部分具有颗粒感，这种颗粒感相对小细胞癌及大细胞癌较为细腻；也可见泡沫样或棉絮样胞质；多有核仁，大小不一，数目不定，核仁体积多小于肝细胞癌、大于鳞癌；部分胞质内可见空泡，具有一定特征性；偶可见多种异常核分裂象、胞质桥、细胞吞噬及细胞单层上皮样排布，这些表现未出现于其他肿瘤细胞标本。鳞癌细胞核内常可见多个细小红染核仁，并多位于核周边；部分角化胞质均匀粉染，细胞核缩小，核浆比减小，核仁显示不清为其主要特征。小细胞癌及大细胞癌细胞染色质呈粗颗粒样深染，多单核，核浆比极大，似裸核，为其主要特征；二者间比较，小细胞癌体积明显小于大细胞癌，且小细胞癌多为团簇分布，未见多核及核仁；部分大细胞癌细胞核内可见圆形细小核仁。肝细胞癌具有较多特征性，染色质均匀深染，缺少颗粒感；核内多有单个大体积单个核仁，多位于细胞核中央。恶性黑色素瘤细胞具有明显特征性，易于鉴别：细胞周边明显的环周伪足突起；核中央可见单个且边界不清红色核仁，体积较大；核或胞质中可见大小不等黑色颗粒物质。

脑脊液中罕见鳞癌、大细胞癌、肝细胞癌等，既往缺少此类细胞在脑脊液中的形态学观察报道。本研究中鳞癌、大细胞癌、肝细胞癌等患者数量少，故根据现有的资料总结分析出的相应特征表现可能并不全面。希望随着脑脊液细胞学检查技术设备的进步，观察及研究的深入，将会有更加全面而系统的脑脊液细胞形态学分析及分类标准，促进实体肿瘤脑膜转移的脑脊液细胞学诊断取得新的发展。