Peutz⁃Jeghers综合征恶性肿瘤相关的STK11基因突变分析

王媛媛 邓秀金 陈静 冯洁 吴保平 王志青

南方医科大学南方医院1肿瘤科，2消化科（广州 510515）

Peutz⁃Jeghers综合征（Peutz⁃Jeghers syndrome，PJS，MIM#175200），亦称黑斑息肉综合征，是一种以胃肠道多发错构瘤样息肉、皮肤黏膜色素沉着为特征，并具高度肿瘤易感性的罕见常染色体显性遗传病［1］。患者不仅胃肠道息肉可恶变，还可伴发胃肠道外许多器官的恶性肿瘤，包括肝脏、胰腺、肺及妇科肿瘤等［2］。PJS息肉可累及消化道任何部位，手术无法进行根治［3］，患者可能同时并发多种肿瘤［4］且发生恶性肿瘤的风险是普通人群的9～18倍［5］，中国PJS患者还表现出较严重的癌症担忧［6］，严重影响其生存质量。因此，寻找恶性肿瘤发生相关的预警信号非常重要。抑癌基因STK11（serine threonine kinase 11，MIM#602216）基因突变被认为是PJS的致病原因［7］，由9个外显子组成，编码区为1 302 bp，编码一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶STK11。目前已发现STK11基因致病突变300余种，但突变类型和恶性肿瘤的关系尚无定论。

本研究将以2个恶性肿瘤高发的PJS家系作为研究对象，报道一种可能与PJS恶性肿瘤发生相关的STK11基因突变类型，为PJS家系进行恶性肿瘤的提前预警、监测及随访提供新的理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料在广东省广州市南方医院肿瘤科病房和消化科门诊采集到2个PJS家系（图1），分别来自广东省（图1A）和福建省（图1B），共调查9例患者的临床病理资料，其中6例患者和10例家系中健康成员提供外周血标本。研究中PJS患者均符合以下4条中的任何1条［8］：（1）2个或多个息肉，经组织学诊断符合PJS特点，即起源于黏膜肌层的平滑肌像树枝样延伸至息肉的黏膜下层；（2）具有PJS家族史且伴有任何数量的PJ息肉；（3）具有PJS家族史且有典型的皮肤黏膜色素沉着；（4）典型的皮肤黏膜色素沉着且伴有任何数量的PJ息肉。另外取100例无亲缘关系的健康人作为正常对照。本次研究遵循知情同意的原则，并取得南方医科大学南方医院医学伦理委员会审查批准。

图1 2个发生恶性肿瘤的Peutz⁃Jeghers综合征家系图谱（*表示提供外周血标本）Fig.1 Pedigree of the PJSfamily associated with carcinomas（Participants in the DNA analysis are marked with an asterisk）

1.2 实验方法

1.2.1 外周血DNA提取取2个家系中PJS患者和健康成员外周血样本16份及100例家系外健康人静脉血，采用上海生工生物工程技术服务有限公司SK1261试剂盒提取外周血DNA。

1.2.2 PCR扩增体系和反应条件对STK11基因9个外显子及侧翼序列进行PCR，引物由广州瑞真生物公司合成，引物序列、PCR反应体系及反应参数见参考文献［9］。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测其纯度。

1.2.3 DNA测序PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳检测后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行Sanger测序，结果采用SequenceScanner 1.0软件（Applied Biosystems）进行分析并与UCSC数据库（http：//genome.ucsc.edu/）中的STK11基因序列进行比对。

1.2.4 MLPA分析MLPA试剂盒SALSA P101⁃B1 STK11购自MRC⁃Holland公司，按照试剂盒操作说明完成MLPA反应［10］。MLPA反应产物用ABI3500DX测序仪进行毛细管电泳，结果采用MRC⁃Holland公司开发的MLPA数据分析专用软件Coffalyser进行分析。拷贝数根据电泳峰面积比值进行判定：正常2拷贝的比值比参考范围为0.85～1.15，比值比0.35～0.65判断为杂合缺失突变，比值比1.35～1.65判断为杂合重复突变。

表1 PJS患者临床特征及恶性肿瘤发生情况Tab.1 Characteristics of affected individuals in two Chinese PJSfamilies

2 结果

2.1 PJS患者临床特征及恶性肿瘤发生情况2个家系中9例PJS患者临床特征见表1。分析发现PJS患者恶性肿瘤发生率为44.4%（4/9），发生恶性肿瘤的平均年龄为38.8岁（29～50岁），其中，家系1患者Ⅲ：3在30和44岁时发生2种不同的恶性肿瘤，分别为卵巢癌和小肠腺癌。此外，患者Ⅳ：1于28岁时发现结肠一直径约3 cm的巨大错构瘤性息肉已发生腺瘤样变，并伴有中重度不典型增生。

2.2 PJS家系STK11基因突变分析应用Sanger测序检测STK11基因突变，在2个PJS家系的患者中均未发现任何变异。随后应用MLPA技术检测大片段重复或缺失，在这两个无亲缘关系的家系中，两位先证者均发现STK11基因第一号外显子（Exon1）缺失突变c.-1114-?_290+?del（图2）。

进一步MLPA验证发现，两个PJS家系中，所有患者均检测到该缺失突变，而家系中表型正常的成员和健康对照者未检出该突变，因此该突变在两个PJS家系中呈现基因型-表型共分离。同时，生物信息学分析提示该突变可能会严重影响STK11基因转录和表达，降低STK11激酶活性。由此推测，STK11基因Exon1缺失突变c.-1114-?_290+?del是导致患者出现PJS临床表现的致病性突变，而非基因多态性，且研究家系中恶性肿瘤高发可能与Exon1缺失突变密切相关。

图2 STK11基因MLPA检测结果（红色箭头指示缺失的Exon1 3个探针位置）Fig.2 MLPA analysis of STK11 gene（Red arrows mark the deleted Exon 1，three probes）

3 讨论

PJS恶性肿瘤严重威胁患者的生命健康，国外研究表明［11-12］PJS患者病死率高达32%，恶性肿瘤是导致死亡的主要原因；恶性肿瘤发生率为19%～32%，平均年龄42～45岁，以胃肠道肿瘤（51%～69%）为主，其次为妇科肿瘤（22%～26%），消化道恶性肿瘤的风险是普通人群的50倍。日前报道PJS患恶性肿瘤的最小年龄为13岁，为小肠腺癌［13］。本研究中2个中国PJS家系恶性肿瘤发生率高，9例PJS患者中4例患癌，1例患者肠道息肉已发生上皮内瘤变，且发生年龄较轻，可见，PJS恶性肿瘤已成为危害患者健康的主要问题，也是临床医生和科研工作者最为关注的问题。然而，该疾病中，研究STK11基因型和表型关系是焦点。

迄今，STK11基因的突变类型、突变位点与PJS患者发生恶性肿瘤的关系仍不清楚。国外研究者先后报道STK11基因第三号外显子突变、第六号外显子突变、羧基端和ⅥB～Ⅷ功能区的错义突变与恶性肿瘤相关［14-16］，本研究组曾报道XI功能区突变可能与PJS错构瘤发生上皮内瘤变有关［10］。而本次研究中值得注意的是，在恶性肿瘤高发的2个独立的PJS家系中同时发现STK11基因Exon1缺失突变，提示这一突变不仅是患者出现PJS临床表现的致病性突变，还可能与恶性肿瘤密切相关。有趣的是，意大利学者RESTA等［17］曾报道一个PJS家系携带STK11基因Exon1基因缺失突变，且其中1例患者43岁时患乳腺癌，另有研究提示STK11基因可能通过影响HER⁃2蛋白表达而导致乳腺癌的发生［18］。这些结果印证了本研究报道的STK11基因一号外显子缺失突变对PJS的致病性以及与恶性肿瘤的相关性，但仍然需要更多国内外PJS患者进一步证实这一结论。

STK11在机体内通过多种机制发挥抑癌作用，主要由N-末端核定位信号结构域、高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域以及C-末端调节结构域组成，其激酶催化区域位于第44-309位氨基酸残基。本研究报道的STK11基因Exon1缺失突变c.-1114-?_290+?del，可能会影响STK11基因转录和表达，降低STK11激酶活性；也可能通过干扰其与STRAD和MO25结合形成复合体，破坏STK11激酶活化功能；还可能通过阻碍AMPK、MAPK等信号通路或通过影响多种与肿瘤发生相关的蛋白如p53、Cdc37、Hsp90、PTEN与STK11的相互作用［15］，进而影响细胞增殖、细胞极性和能量代谢［19］，最终导致PJS患者息肉形成甚至恶性肿瘤发生。我们将在后续研究中进一步探讨STK11基因Exon1缺失突变的致病及致癌机制，从而为PJS疾病的精确诊疗提供新的有效途径。

总之，本研究联合应用Sanger测序和MLPA检测技术发现了2个中国PJS家系共有的STK11基因致病性突变，即Exon1缺失突变c.-1114-?_290+?del，且该突变很可能与PJS恶性肿瘤密切相关，为PJS家系进行遗传咨询、产前诊断［20］以及恶性肿瘤预警、监测和随访提供了新的理论依据。