维生素E琥珀酸酯联合5-氟尿嘧啶和5′-脱氧氟脲苷促进人结肠癌细胞凋亡

王绮雯 张继民 李爱群 邹湘才

广州医科大学附属第二医院1外科实验室，2胃肠外科，3心研所（广州 510260）

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是常见的消化道恶性肿瘤，在全球范围内肿瘤相关的病死率中，结直肠癌处于第3位［1］。由于生活方式的改变，近年我国的结直肠癌总体发病率也呈上升趋势。虽然CRC的诊断和治疗均取得了较快发展，但CRC的治疗仍然以外科手术为主，许多患者因早期症状不明显导致就诊时已属中晚期，预后较差［2］。如何提高CRC患者生存质量已成为临床研究的热点。目前结肠癌的治疗是以手术为主的综合治疗，而辅助化疗已成为综合治疗的重要组成部分。临床上常用的化疗方案多以5-氟尿嘧啶（5⁃FU）为基础，5⁃FU作为临床上用于消化道恶性肿瘤化疗的主要药物，因有明显的副作用受到限制。近年推出了具有较少毒副作用、无直接细胞毒性的 5⁃FU 前体药物，如 5′-脱氧氟脲苷（5′⁃DFUR）、卡培他滨等。

维生素E琥珀酸酯（vitamin E succinate，VES）是天然维生素E的衍生物，近年因具有抗肿瘤功效而备受关注。研究［3］证明VES具有促进多种肿瘤细胞发生凋亡，并且对正常细胞没有毒副作用。无毒副作用的VES联合临床常用的化疗药物5⁃FU、5′⁃DFUR，能否增强5⁃FU、5′⁃DFUR的化疗作用，成为临床的辅助化疗药呢？本文拟通过VES分别联合5⁃FU、5′⁃DFUR，观察其对人结肠癌LS174T细胞的影响，旨在阐明VES分别联合5⁃FU、5′⁃DFUR诱导人结直肠癌细胞凋亡中的作用机制，为探索更多结肠癌辅助化疗的联合化疗方案提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 细胞系和主要实验试剂人结肠癌细胞系LS174T购自中国科学院上海生命科学研究院。VES、5⁃FU和5′⁃DFUR购于Sigma公司，胎牛血清（FBS）和DMEM培养液购于Gibco公司。MTS（四唑化合物）粉剂购于promega公司。Annexin V⁃FITC/PI细胞凋亡试剂盒购于联科生物。Bid、Bax抗体购于生工生物，bcl⁃2抗体购于博士德生物。

1.2 细胞培养和药物处理LS174T细胞用含10%FBS的DMEM完全培养基体外常规培养。VES用无水乙醇溶解配制成25 mmol/L的储备液，使用时用完全培养基稀释至所需浓度；5⁃FU和5′⁃DFUR用完全培养基溶解配制成3 mg/mL的储备液，使用时再用完全培养基稀释至所需浓度。

1.3 MTS法检测细胞的增殖情况将LS174T细胞接种于96孔培养板中，每孔加100μL含2×103个细胞的完全培养基，接种3板，每板铺60个孔，外周孔中加入200μL无菌PBS。在37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h，分别加入用完全培养基稀释的 VES、5⁃FU 与 5′⁃DFUR，使 VES最终浓度为60、40、30、20、15、10、7.5、5、2.5 μmol/L，5⁃FU最终浓度为 128、64、32、16、8、4、2、1、0.5 μmol/L，5′⁃DFUR 最终浓度为 64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25 μmol/L，同一浓度设6个复孔，正常组加入不含药物的完全培养基。继续培养24 h后，加入40μL DPBS缓冲液溶解的MTS与PMS的混合物（20∶1），37℃继续孵育4 h后，在490 nm波长条件下测量每孔吸光度值（A490），选择出VES 、5⁃FU与5′⁃DFUR的最大无毒剂量。最大无毒剂量VES分别与最大无毒剂量5⁃FU、5′⁃DFUR联合作用，重复上述MTS实验，检测联合作用对细胞的影响。

1.4 倒置显微镜观察细胞形态6孔培养板中，每孔加1 mL含5×105个细胞的完全培养基，在37℃、5%CO2的培养箱中培养24 h，用完全培养基稀释VES 、5⁃FU与5′⁃DFUR，使其终浓度为0，20 μmol/L VES，1 μmol/L 5⁃FU，2 μmol/L 5′⁃DFUR，20 μmol/L VES+1 μmol/L 5⁃FU，20 μmol/L VES+2 μmol/L 5′⁃DFUR。继续培养 24 h后，倒置显微镜下观察细胞形态。

1.5 Western blot检测细胞 Bid、Bax、bcl⁃2 的表达收集不同处理组的细胞，常规裂解，提取总蛋白，BCA试剂盒检测总蛋白浓度，等量上样，SDS⁃PAGE电泳分离，低温转移至硝酸纤维素膜，封闭，加入一抗4℃摇床过夜，洗膜后加入用相应的二抗，室温摇床放置1 h。洗膜后进行化学发光显色并对图像进行拍照和分析。

1.6 流式细胞仪技术检测细胞凋亡收集不同处理组处理24 h后的细胞，4℃预冷PBS洗2次，用结合缓冲液将细胞浓度调整为1×106/mL。取100μL细胞悬液于5 mL流式管中，加入5μL Annexin V⁃FITC 和5 μL PI，轻轻混匀，室温条件下避光反应15 min，最后加入400μL预冷的PBS，流式细胞仪（FACS）分析。

1.7 统计学方法采用SPSS19.0统计学软件进行统计学分析，结果以均数±标准差表示，两组数据之间比较采用t检验，3组以上组间比较均采用单因素方差分析（ANOVA），P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 VES、5⁃FU与5′⁃DFUR的最大无毒剂量分别以不同浓度的 VES、5⁃FU 与 5′⁃DFUR 处理LS174T细胞24 h，MTS法检测细胞增殖情况。结果显示，VES 、5⁃FU与5′⁃DFUR对细胞增殖均有抑制作用，且呈量效关系，其最大无毒剂量分别为20μmol/L、1 μmol/L、2μmol/L（见表1）。

2.2 最大无毒剂量VES、5⁃FU、5′⁃DFUR联合作用对细胞增殖的影响V ES最大无毒剂量（20μmol/L）分别与5⁃FU最大无毒剂量（1 μmol/L）、5′⁃DFUR最大无毒剂量（2μmol/L）联合作用，MTS法检测细胞活力。结果显示，与正常组、VES组相比，VES+5⁃FU组与VES+5′⁃DFUR组的细胞活力明显降低（P＜0.05）。由此说明，VES能增强5⁃FU、5′⁃DFUR抑制人结肠癌细胞增殖的作用，特别是VES与5′⁃DFUR联合作用效果尤为显著（见表2）。

2.3 倒置显微镜观察细胞形态LS174T细胞接着于6孔板中常规培养，分6组（0，20μmol/L VES，1 μmol/L 5⁃FU，2 μmol/L 5′⁃DFUR，20 μmol/L VES+1 μmol/L 5⁃FU，20 μmol/L VES+2 μmol/L 5′⁃DFUR）处理24 h。镜下观察细胞形态发现，正常组与VES组细胞呈梭形，折光性良好，胞质饱满，核质清晰，细胞之间连接紧密；1 μmol/L 5⁃FU、2 μmol/L 5′⁃DFUR组细胞呈梭形，有些细胞两端出现细长的伪足，折光性较好，胞质比较饱满，核质较清晰，细胞间距增加，有少量死细胞。联合作用的两组细胞（20μmol/L VES+1μmol/L 5⁃FU，20μmol/L VES+2 μmol/L 5′⁃DFUR）细胞呈圆形，折光性明显变差，胞质饱满度较差，核质不清晰，细胞间距增加，死亡细胞明显增多。

表1 不同浓度VES5、5⁃FU、5′⁃DFUR对LS174T细胞增殖的影响Tab.1 Effects of different concentrations of VES，5⁃FU，5′⁃DFUR on proliferation of LS174Tcells（n=6）

表2 VES与5⁃FU、5′⁃DFUR联合作用对LS174T细胞增殖的影响Tab.2 Effects of VEScombined with 5⁃FU，5 ′⁃DFUR on proliferation of LS174Tcells

2.4 VES分别与5⁃FU、5′⁃DFUR联合作用对细胞凋亡相关蛋白（bid、bax、bcl⁃2）表达的影响LS174T细胞常规培养，同2.3分组处理细胞，Western blot法检测细胞中bid、bax、bcl⁃2的表达情况。结果显示，20 μmol/L VES，1 μmol/L 5⁃FU，2 μmol/L 5′⁃DFUR处理细胞24 h后，细胞中 bid、bax、bcl⁃2的蛋白表达与正常组相比差异无统计学意义（P＞0.05）；20 μmol/L VES+1 μmol/L 5⁃FU，20 μmol/L VES+2 μmol/L 5′⁃DFUR作用细胞24 h后，细胞中bid、bax的蛋白表达明显高于正常组与VES组，bcl⁃2明显低于正常组与VES组（P＜0.05）（见图2）。

图1 VES与5⁃FU、5′⁃DFUR联合作用对细胞形态的影响（× 100）Fig.1 Effects of VEScombined with 5⁃FU，5′⁃DFUR on cell morphology（× 100）

2.5 VES分别与5⁃FU、5′⁃DFUR联合作用对LS174T细胞凋亡的作用同2.3分组处理LS174T细胞24 h后，流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示，与正常组、VES组相比，VES+5⁃FU组（35.93± 2.78）%与VES+5′⁃DFUR组（55.50± 0.95）%的凋亡率明显升高（P＜0.05）；5⁃FU组（7.90 ± 0.75）%与5′⁃DFUR组（4.53±0.45）%的凋亡率也有所升高（P＜0.05），但升高的幅度没有联合作用组大。其中，VES+5′⁃DFUR 组凋亡率最高，说明 VES 与 5′⁃DFUR联合作用的效果最为显著（见图3、表3）。

图2 VES分别与5⁃FU、5′⁃DFUR联合作用对bid、bax、bcl⁃2表达的影响Fig.2 Effects of VEScombined with 5⁃FU，5′⁃DFUR on bid，Bax and bcl⁃2 expression

图3 VES分别与5⁃FU、5′⁃DFUR联合作用对LS174T细胞的凋亡作用Fig.3 Effects of VEScombined with 5⁃FU and 5′⁃DFUR on the apoptosis of LS174Tcells

表3 VES与5⁃FU、5′⁃DFUR联合作用对LS174T细胞凋亡的影响Tab.3 Effects of VEScombined with 5⁃FUand 5′⁃DFUR on the apoptosis of LS174Tcells

3 讨论

近年来，随着环境污染日益严重以及饮食结构的改变，我国结肠癌的发病率与病死率加速上升，已经严重威胁到人类的健康。目前，结肠癌治疗是以手术治疗为主的综合治疗，辅助化疗成为综合治疗的重要组成部分。5⁃Fu现为结直肠癌标准化疗的基础，因有较多的毒副作用而受到限制。近年逐渐推出较少毒副作用、无直接细胞毒性的 5⁃FU 前体药物如 5′⁃DFUR、卡培他滨等。5⁃FU前体药物之所以无细胞毒性，与胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）有很大的关系。TP是5⁃FU前体类药物体内转化的关键酶，其催化得到终产物5⁃FU从而发挥抗肿瘤作用。高TP表达能增强患者对5⁃FU前体药物化疗的敏感性，提高化疗效果，从而改善肿瘤患者的预后［4］。张继民等［5］用ELISA法对LS174T、LOVO等6株结直肠癌细胞株进行TP蛋白水平检测，发现LS174T细胞检测出少量的TP蛋白（0.5 Unit/mg），远高于其他结直肠癌细胞株。本研究利用流式细胞仪技术检测细胞凋亡，结果表明VES+5′⁃DFUR组（55.50±0.95）的诱导细胞凋亡能力比VES+5⁃FU组（35.93±2.78）强，出现这种结果与LS174T细胞存在少量TP蛋白有直接关系。存在于LS174T细胞中的少量TP在细胞内将无细胞毒性5′⁃DFUR转化为5⁃FU，比直接使用具有毒性的5⁃FU的抗肿瘤效果更好。

VES作为维生素E的衍生物，对肿瘤细胞有显著的凋亡杀伤作用，并且对正常细胞没有明显毒性反应［3］。前期研究表明，VES可诱导胃癌细胞［6］、肺癌细胞［7］、乳腺癌细胞［8］、食管癌细胞（Ec109）［9］的凋亡。bcl⁃2 家族蛋白在程序性细胞死亡中起着关键性作用，通常定位于线粒体膜、内质网膜以及外核膜上。线粒体途径被bcl⁃2家族成员控制，它是凋亡的监管中心，通过上调或下调bcl⁃2家族表达，以及通过其将信号级联放大，从而控制细胞凋亡。bcl⁃2家族目前至少有25个成员，根据其功能分为抗凋亡蛋白和促凋亡蛋白［10］。bcl⁃2 蛋白是 bcl⁃2 家族中抗凋亡蛋白的代表，而bax和bid则是促细胞凋亡蛋白的代表。bcl⁃2蛋白可与bax蛋白形成异源二聚体，阻断bcl⁃2抑制凋亡的功能，bax表达增加，细胞凋亡增加，反之则细胞存活，bcl⁃2/bax的相对比率是调节细胞凋亡的关键因素［11］。bid蛋白是bcl⁃2家族的促凋亡蛋白，可被Caspase 8酶切成具有活性的bid蛋白，进一步作用于线粒体，导致线粒体中的Cyt C释放到胞浆中；bid蛋白与bax蛋白起协同作用，引起bax蛋白构象发生变化，使其与线粒体紧密结合，从而引起线粒体损伤［12-13］。本研究利用MTT法检测观察细胞增殖情况，结果发现，与VES组相比，VES与5⁃FU、5′⁃DFUR联合作用时能够抑制人结肠癌细胞的增殖，特别是VES+5′⁃DFUR组的联合作用效果尤为显著，差别有统计学意义。Western blot与细胞凋亡检测结果显示，与VES组相比，人结肠癌细胞在VES与5⁃FU、5′⁃DFUR的联合作用下，促凋亡蛋白bid、bax表达增强，抗凋亡蛋白bcl⁃2表达降低，诱导细胞发生凋亡的能力增强。其中VES+5′⁃DFUR组的凋亡率（55.50±0.95）%高于VES+5⁃FU组（35.93±2.78）%，差别有统计学意义。

综上所述，VES+5′⁃DFUR组的诱导细胞凋亡能力最强，其促进人结肠癌LS174T细胞凋亡的机制与bid、bax蛋白的上调、bcl⁃2蛋白的下调有关。然而，VES与5⁃FU、5′⁃DFUR的联合作用是通过何种机制改变bid、bax、bcl⁃2蛋白的表达，仍需进一步探讨。随着对VES的深入研究，其有望成为5′⁃DFUR化疗药物发挥疗效的增敏剂，从而为临床化疗提供一个既能保证对肿瘤细胞的杀伤力，又能减少化疗药物用量的方案。