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二甲双胍对小鼠睾丸间质细胞的体外抑制作用及其机制研究

2018-08-30李蕊秀赵昍朋刘婧吴家栋何瑞平岳鑫张传领肖瑞

实用医学杂志 2018年16期
关键词:睾丸细胞周期试剂盒

李蕊秀 赵昍朋 刘婧 吴家栋 何瑞平 岳鑫 张传领 肖瑞

内蒙古医科大学1内蒙古自治区分子病理学重点实验室,2药学院(呼和浩特010059)

不孕不育是一个严峻的问题,受到社会广泛关注。据统计,15%的育龄夫妇都受此问题困扰,这其中约有50%的不孕不育因素与男性有关[1]。男性不育症是一种由多因素引起的疾病,临床表现一般为精液中精子密度低以及由于精子发生异常导致精液中无精子细胞存在[2]。精子发生是一个复杂的过程,它依赖并受控于睾丸中存在的多种类型的生殖细胞。睾丸支持细胞、睾丸间质细胞以及发育中的生殖细胞密切合作,保证精子发生正常运行,产生成熟的精子使卵母细胞受精[3]。

二甲双胍属于胰岛素增敏剂,是供给2型糖尿病患者一线口服治疗的人工合成制剂[4]。由于其降糖作用明显且副作用较小,目前已在临床上应用超过50年,现在全世界范围内每天有超过1亿的糖尿病患者在服用二甲双胍[5]。最近几年,人们发现二甲双胍还有很多其他作用。例如,KATO等[6]称二甲双胍可抑制肿瘤细胞的增殖能力;CREANGA等[7]发现二甲双胍联合克罗米芬可通过诱导排卵改善多囊卵巢综合征妇女的生育能力;BERTOLDO等[8]指出二甲双胍不仅具有降血糖作用,它还可以作用于包括生殖系统在内的多种人体组织。

对于糖尿病男性患者来说,睾丸组织的氧化损伤以及雄激素分泌障碍可能会不可逆地影响精子发生,进而导致精子质量下降,并直接或间接导致男性不育[9]。目前有关二甲双胍与男性生殖的相关研究很少。因此,有必要去研究二甲双胍对男性生殖系统的影响,评估其潜在的有害或有益的价值。本研究利用体外培养的TM3细胞,研究二甲双胍对细胞增殖、周期和凋亡的影响,以及相关的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试剂甲福明盐酸盐(二甲双胍)购自Sigma公司,噻唑兰(MTT)购自北京chembase科技有限公司,反转录试剂盒购自北京TransGen生物技术有限公司,荧光定量试剂盒购自北京TransGen生物技术有限公司,SDS⁃PAGE凝胶试剂盒购自江苏Beyotime生物技术研究所,Annexin V⁃FITC/PI凋亡试剂盒购自BD公司,马血清购自HyClone公司,DMEM/F12细胞培养基购自Gibco公司。小鼠睾丸间质细胞(TM3)购于上海中科院细胞库。

1.2 MTT法检测二甲双胍对TM3细胞体外增殖的影响常规消化法收集处在对数生长期的TM3细胞沉淀并计数,调整细胞悬液浓度后使96孔板中每孔接种的细胞数约为1×104个/孔。次日待细胞贴壁依次分别加入含有不同浓度二甲双胍(0、2.5、5、7.5、10 mmol/L)的培养基,每组设5个复孔,待三张孔板分别在培养箱中培养24、48、72 h后,避光条件下每孔加入20μL MTT孵育4 h后弃去上清,每孔加入150μL DMSO,置于震荡器上避光低速振荡10 min,用酶标仪测定各孔在490 nm波长处的吸光度并计算细胞抑制率:细胞抑制率(%)=[(对照孔OD值-实验孔OD值)/(对照孔OD值-空白孔OD值)]×100%。

1.3 流式细胞术检测二甲双胍对细胞凋亡的影响将TM3细胞用常规消化法收集,按细胞数为2×105个/孔接种于6孔板中。次日按照半抑制浓度6.7 mmol/L加入二甲双胍配制成实验组培养基,对照组与实验组各孔分别加入各自的培养基,培养48 h后收集细胞沉淀用预冷PBS洗涤。按照调亡试剂盒的说明向每管加入相应比例1×Binding buffer、Annexin V⁃FITC、PI并振荡混匀,室温下避光孵育15 min。1 h内上流式细胞仪检测,计算活细胞、早/晚期调亡细胞的百分率。

1.4 流式细胞术检测二甲双胍对细胞周期的影响常规消化法收集TM3细胞,按细胞数为2×105个/孔接种于6孔板中。待细胞贴壁弃去原培养基,对照组与实验组各孔分别加入各自的培养基继续常规培养48 h后,收集细胞沉淀。用预冷的PBS洗涤并重悬细胞,加入70%乙醇4℃固定过夜。次日弃去固定液并用预冷的PBS洗涤,加入0.5 mL PI/RNase Staining Buffer重悬细胞,经200目滤网过滤后,在室温下避光孵育15 min;1 h内上流式细胞仪检测,用Modifit软件分析各细胞周期的比例。

1.5 细胞RNA提取和荧光定量PCRTrizol法提取TM3细胞总RNA,以1 000 ng总RNA按反转录试剂盒进行反转录。将反转录后的cDNA作为模板,依照TransGen荧光定量试剂盒说明书,用7500 fast荧光定量PCR仪(美国AB公司)进行检测。反应体系:TransStart Top Green qPCR SuperMix(2×)10μL,Passive Reference DyeⅡ(50×)0.4μL,ddH2O 6.8μL,上下游引物各0.4μL,cDNA 2μL。反应条件:94 ℃ 30 s;94 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40个循环。PCR引物见表1,以GAPDH作为内参。用2-△△CT法分析结果。

1.6 Western blot细胞总蛋白提取后,用BCA定量试剂盒测定蛋白浓度。调整浓度为20 ng,按1∶1的比例加入2×SDS上样缓冲液,95℃5 min后立即冰浴,10%SDS⁃PAGE凝胶上样 20 μL,常规电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭,一抗(AMPK:1∶2 000、P⁃AMPK 1∶1 000、α⁃tubulin 1∶2 000),摇匀仪上4℃孵育过夜。室温孵育与一抗相对应的二抗(辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 1∶2 000稀释)1 h,TBST洗涤2次,每次15 min;最后1次用TBS洗涤10 min。取出NC膜,在避光条件下将其置于Odessey CLX红外激光成像系统,扫描并观察结果。

表1 基因引物信息Tab.1 Gene primer information

1.7 统计学方法数据以s表示,采用SPSS 13.0统计软件进行分析,两组样本均数比较行t检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MTT法检测二甲双胍对TM3细胞体外增殖能力的影响TM3细胞经不同浓度的二甲双胍(2.5、5、7.5、10 mmol/L)干预48 h后,细胞活性分别为81.68±1.54、64.19±1.62、46.45±2.02、37.90±2.03(图1A)。由此得知随着二甲双胍的作用浓度逐渐增加,TM3细胞的细胞活性也逐渐降低。此外,还在不同时间点(24、48、72 h)研究了二甲双胍对TM3细胞增殖的作用。发现随着药物作用浓度逐渐增加和药物作用时间逐渐延长,二甲双胍对TM3细胞增殖的抑制作用亦逐渐增加,表现为浓度依赖性和时间依赖性(图1B)。

图1 MTT检测结果Fig.1 MTTassay results

2.2 二甲双胍对TM3细胞凋亡的影响二甲双胍可显著抑制TM3细胞的增殖,细胞增殖的抑制是否通过凋亡途径发生?采用流式细胞术的方法检测TM3细胞经过二甲双胍处理后的凋亡情况。实验组给予半抑制浓度6.7 mmol/L的二甲双胍,48 h后将实验组与对照组细胞收集并进行Annexin V⁃FITC/PI染色来标记细胞的凋亡情况。发现二甲双胍并未诱导TM3细胞发生明显的调亡(图2A、B);二甲双胍对该细胞的凋亡诱导率为(9.34±0.71)%,与对照组细胞(8.77±0.25)%相比差异无统计学意义(P>0.05,图2C)。对此,在蛋白水平上也进行了验证,众所周知caspase⁃3的激活是细胞凋亡的重要标志。将TM3细胞经二甲双胍干预48 h后提取蛋白做Western blot,以乳腺癌细胞MDA⁃MB⁃231做阳性对照,结果发现TM3细胞未见表达,而阳性对照乳腺癌细胞有表达(图2D)。

图2 二甲双胍干预后TM3细胞调亡的结果Fig.2 Apoptosis of TM3 cells after metformin intervention

2.3 二甲双胍对TM3细胞周期的影响采用流式细胞术检测二甲双胍对TM3细胞周期的影响。发现TM3细胞经6.7 mmol/L二甲双胍干预48 h后,实验组G2/M期细胞所占比例显著高于对照组(图3A、B)。同样TM3细胞实验组与对照组的G2/M期细胞所占比例亦差异极显著(图3C)随后,通过荧光定量PCR方法检测了TM3细胞经过二甲双胍干预后调控细胞周期蛋白cyclin D1和cyclin B1的情况。用半抑制浓度6.7 mmol/L的二甲双胍处理该细胞48 h后,与对照组相比,实验组cyclin D1和cyclin B1的表达下调(P<0.05,图3D)。

2.4 二甲双胍激活TM3细胞AMPK信号通路Western blot方法检测二甲双胍是否可以激活TM3细胞中的AMPK信号通路从而引起细胞增殖的抑制和周期的阻滞。将TM3细胞用半抑制浓度6.7 mmol/L的二甲双胍处理,48 h后提蛋白,以α⁃tubulin作为内参蛋白,结果显示TM3细胞实验组的磷酸化的AMPKα(Thr172)与对照组相比略有升高,而未磷酸化的AMPK的表达相应的下降(图4)。

3 讨论

二甲双胍(1,1--二甲基双胍盐酸盐)作为一种治疗糖尿病的有效药物,可提高胰岛素的敏感性并降低空腹胰岛素水平[10]。过去几年里,人们发现二甲双胍还有很多其他作用。例如,有报道称,二甲双胍可抑制多种肿瘤细胞的生长和增殖[11-12],其与卡铂合用增加卵巢癌的化疗效果[13]。也有报道称,这种药物会降低糖尿病妇女乳腺癌的发病率[14]。同时,二甲双胍已被应用于女性多囊卵巢综合征的治疗,诱导排卵并提高妊娠率[7]。ADARAMOYE等[15]对成年雄性大鼠采用连续21d灌注二甲双胍,结果显示大鼠睾丸内的精子数量与精子活力明显下降。此外,还表现为睾丸组织损伤和睾丸功能障碍,并发睾丸脂质过氧化。这表明在二甲双胍干预下的动物体内,成熟精子的生成受到严重影响。

图3 二甲双胍对TM3细胞周期的影响结果Fig.3 Effect of metformin on cell cycle of TM3

图4 Western blot检测TM3细胞AMPK和p⁃AMPKα(Thr172)的表达情况Fig.4 Western blot detection of TM3 cells AMPK and p⁃AMPKα(Thr172)expression

关于二甲双胍对男性生殖细胞增殖和凋亡的体外实验,目前仅有FAURE等[16]进行了一项体外细胞实验,研究二甲双胍对公鸡睾丸支持细胞的影响,他们发现,二甲双胍抑制了公鸡睾丸支持细胞的增殖,但并未诱导细胞发生凋亡,且细胞的形态亦没有改变。本研究选择小鼠睾丸支持细胞作为体外实验的研究对象,采用不同浓度二甲双胍分别干预,结果表明二甲双胍对TM3细胞的体外增殖有抑制作用,并表现为浓度依赖性和时间依赖性。采用IC50作用浓度的二甲双胍并没有诱导TM3细胞发生明显的凋亡,由此推测二甲双胍对小鼠睾丸间质细胞增殖的抑制可能是通过其他机制来实现的。细胞周期的顺利运行是细胞增殖的关键,本研究釆用流式细胞仪检测二甲双胍对TM3细胞周期的影响,发现二甲双胍干预后处于G0/G1期的TM3细胞所占比例显著减少,而处于G2/M期的细胞比例显著增多。同时,还进行了实时荧光定量PCR实验,结果显示二甲双胍干预可下调该细胞cyclin B1及cyclin D1 mRNA的表达。说明调控细胞周期关键蛋白并使细胞周期阻滞在G2/M期可能是二甲双胍抑制TM3细胞增殖的重要机制。有研究[17-18]显示AMPK通路可能调控睾丸支持细胞的功能。Western blot结果说明二甲双胍能够激活TM3细胞中的AMPK信号通路,通过该通路影响睾丸细胞的生殖和发育。

综上所述,本次研究发现了二甲双胍具有抑制生殖细胞的体外增殖能力,这种抑制作用可能是通过诱导生殖细胞周期阻滞在G2/M期,并且激活AMPK通路实现的。然而,目前关于二甲双胍作用于男性生殖系统的确切机制还不完全清楚,有待未来继续研究,希望这些实验数据可以为以后研究二甲双胍与男性生殖提供一些理论依据和实验基础。

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