IFN⁃γ通过下调PD⁃1和PD⁃L2信号通路拮抗CD33来干预肺结核发展的机制

张艳丽 杨卫 武丽 李福建 张贵贤

1保定市传染病医院结核科（河北保定 071000）；2保定市第一中心医院呼吸科（河北保定 071000）

结核病（tuberculosis，TB）每年导致860万新病例和170万人死亡［1］。表达IFN⁃γ的Th1细胞和产生IL⁃17的Th17细胞在控制结核感染中起关键作用。最近，髓系来源的抑制性细胞（MDSC）与T细胞反应的不平衡相关并参与TB的疾病进展。MDSC具有抑制T细胞应答的强大能力。MDSCs可分为两类：显示CD14⁃CD15+CD11b+CD33+HLA⁃DRlow/-表型的粒细胞MDSCs和具有CD14+CD15⁃CD11b+CD33+HLA⁃DRlow/-表达的单核细胞MDSCs［2］。高度抑制的MDSC通过细胞—细胞相互作用发挥其功能，包括共刺激/抑制分子如B7⁃H1（PD⁃L1）、B7⁃H3［3］、CD40和CD80。在IFN⁃γ存在的情况下通过GM⁃csf和IL⁃6体外产生人CD33+MDSC可用作鉴定IFN⁃γ的功能。

1 对象与方法

1.1 研究对象活动性肺结核（LTBI）患者120例，LTBI患者80例，健康体检者40例。所有参与者都是成年人，不包括孕妇和儿童。肺结核的诊断基于阳性痰涂片和（或）培养结果和胸片。对于细菌培养结果阴性的患者，通过胸片、临床症状确诊，经抗结核化疗后症状改善和影像学改善。健康人从本院进行健康体检随机抽取。健康个体筛选标准：（1）无发热，咳嗽或其他活动性结核体征；（2）体格检查结果正常，X线正常；（3）TST检查，T⁃SPOT阴性。排除标准：恶性肿瘤，HIV感染或摄入免疫抑制剂的个体。

1.2 体外产生人类MDSC通过聚蔗糖梯度离心从健康个体分离PBMC，并在含有10%FBS（Sigma Aldrich，Munich，Germany），2 mmol谷氨酰胺，100 IU/mL青霉素和100 mg/mL链霉素的RPMI⁃1640培养基。为了产生功能性MDSC，在重组人细胞因子GM⁃csf，IL⁃6（10 ng/mL）和 IFN⁃γ（10 ng/mL）（R&D Systems，Minneapolis，MN，USA）的存在下，在完全培养基中以5×105个细胞/mL在T⁃25烧瓶中培养PBMC 7 d。用单独培养基和单核细胞培养的PBMC［通过磁性活化细胞分选抗CD14微珠（BD Pharmingen）分离］用作对照。培养操作重复运行。培养基和细胞因子每3天进行一次。1周后，收集所有细胞并除去贴壁细胞。通过FACSAria细胞分选仪（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）分离CD33+或CD33+HLA⁃DR+/-细胞。

在BD LSRFortessa流式细胞仪（BD Bioscienc⁃es，Franklin Lakes，NJ，USA）上测量细胞并使用Facs Diva软件（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）进行分析。使用FlowJo软件（Tree Star Inc，Ash⁃land，OR，USA）进行数据分析。通过流式细胞术发现分离的细胞群的纯度为90%。

1.3 流式细胞仪为了表面染色，收获PBMC，洗涤并用荧光缀合的mAbs或同种型匹配的对照的混合物在冰上染色30 min。MDSC的表型通过CD11b（ICRF44），CD33（WM53），HLA⁃DR（G46⁃6），CD14（MφP9），CD15（W6D3），CD80（BB1），CD86（2331），PD⁃L1（MIH1）和PD⁃L2（MIH18）的表达来评估。通过CD4（RPA⁃T4），CD8（RPA⁃T8），HLA⁃DR（L243），CD25（M⁃A251）和 CD69（FN50）（均来自BDPharmingen）来评估T细胞的表面表达。对于细胞内染色，在brefeldin A（eBioscience）存在下用佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯（PMA）和伊屋诺霉素（Invitrogen，Carlsbad，CA）模拟细胞4 h，然后收获。表面染色后，将细胞固定，透化并用IFN⁃γ（B27），Foxp3（236A/E7）和相应的同种型对照（BD Pharmingen）染色。用膜联蛋白V（BD Pharmingen）和PI（BD Pharmingen）染色检测细胞活力和细胞死亡。在流式细胞仪（BD LSRFortessa）（BD Biosci⁃ences）上通过流式细胞术分析细胞表型。数据是作为活细胞门内设置的50 000个事件中标记细胞的分数获得的，并使用FlowJo软件（Tree Star）进行分析。

1.4 T细胞抑制测定分选CD33+或CD33+HLA⁃DR+/-细胞的抑制功能通过在下列抑制测定中抑制自体T细胞增殖的能力来测定。通过抗-CD3微珠和磁性柱分离（Miltenyi Biotec）从PBMC分离的T细胞被CFSE标记（5 μmol/L，Sigma⁃Aldrich），并以1×105个细胞/孔接种在96孔平板中。先前从细胞因子诱导培养系统分离的CD33+或CD33+HLA⁃DR+/-与CD3+T细胞以1∶4，2∶4和4∶4的比率共培养。通过抗CD3/CD28（1 μg/mL）和IL⁃2（50 U/mL；R＆D Systems）诱导T细胞增殖。3 d后分析CD4+或CD8+T细胞的增殖。对于所指出的研究，将FACS分选的抑制细胞与T细胞在下列抑制剂存在下共培养：10 mmol/L NG⁃单甲基-L-精氨酸（L⁃NMMA），100 μmol/L N⁃羟基-正-L-精氨酸（NOHA）（Sigma⁃Aldrich）和 10 μg/mL抗 PD⁃1和IgG对照（R&D Systems）。以15 000个事件的活淋巴门控细胞的增殖百分比获得数据。

1.5 T细胞的增殖原代CD4+T细胞（CD4+CD45RO⁃CD62LhiCD25⁃）由 PBMC 阴性选择磁珠（BD Pharmingen）纯化，分离的T细胞群的纯度为95%。在Th1或Treg倾斜条件下，在96孔U形底板中以1×105个细胞/mL切下初始CD4+T细胞。Th1 条件：在 IL⁃12（10 ng/mL）和 IFN⁃γ（10 ng/mL）存在下用平板结合的抗CD3（4μg/mL），抗CD28（1μg/mL）刺激初始T细胞。5 d后，用重组IL⁃2（50 U/mL）（BD Pharmingen）补充培养物。Treg条件：在TGF⁃β（5 ng/mL）和IL⁃2（10 ng/mL），抗IFN⁃γ（10μg/mL）和抗IL⁃4（10μg/mL）存在下，用平板结合的抗-CD3（4 μg/mL），抗-CD28（1 μg/mL）刺激初始T细胞。培养基每3天添加一次细胞因子和中和抗体。第7天，在IL⁃2（10 ng/mL）存在下收获细胞，洗涤，计数并与先前分离的CD33+HLA⁃DR+细胞以1∶1的比率共培养。第12天，分析细胞的IFN⁃γ产生和FoxP3表达。

1.6 Transwell分析从细胞因子诱导培养系统分离的CD33+HLA⁃DR+/-细胞在抗CD3/CD28（1 μg/mL）和IL⁃2（10 ng/mL）存在下与自体CFSE标记的CD3+T细胞以1∶2的比率共培养3 d。当将CD3+T细胞置于上Transwell室（Costar⁃Corning，Amsterdam，The Netherlands）时，将 CD33+HLA⁃DR+/-细胞置于下Transwell室中。

1.7 一氧化氮（NO）按照制造商的方案（Promega，Madison，WI）测量血浆中的NO含量。将等体积的上清液（50μL）与Greiss试剂A和B混合，并在室温下避光孵育10 min。使用酶标仪（Bio⁃Rad，Hercules，CA）测量550 nm处的吸光度。通过比较测试样品的吸光度值与通过连续稀释0.25 mmol/L亚硝酸钠产生的标准曲线来确定亚硝酸盐浓度。

1.8 精氨酸酶活性测定在来自分离的CD33+HLA⁃DR+细胞的细胞裂解物中测量精氨酸酶的活性［33］。简而言之，将细胞用0.1%Triton X⁃100裂解30 min，随后加入25 mmol/L TrisHCl。通过在56℃加热10 min使酶活化。通过将裂解物与0.5 M L-精氨酸和10 mmol/L MnCl2在37℃孵育120 min进行精氨酸水解。加入α-异亚硝基苯丙酮（溶于100%乙醇）后，在95℃加热30 min，用酶标仪（Bio⁃Rad）在540 nm处测量尿素浓度。基于连续稀释的尿素标准曲线计算尿素含量（以上使用的药剂均来自德国慕尼黑的西格玛奥德里奇公司）。

1.9 统计学方法分别使用GraphPad Prismversion 5.0和SPSS Statistics 17.0，通过单因素方差分析（ANOVA）和Kruskal⁃Wallis检验评估临床患者中MDSC水平的变化。如果发现显著差异，则进行学生t检验以分析组之间的差异。使用Spearman秩和检验分析不同参数之间的相关性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结核病患者外周血单核细胞MDSCs水平升高与HC相比，在TB患者中清楚地观察到HLA⁃DR-/lowCD11b+CD33+MDSCs的显著更高的群体。MDSCs主要是CD14阳性而不是CD15阳性。LTBI患者的MDSCs水平显著高于HC患者，未经治疗的活动性结核病患者的MDSCs水平高于LTBI患者，接受抗结核治疗的结核病患者中MDSCs的频率显著降低。见图1。

图1 MDSCs在结核病患者中的扩展Fig.1 The expansion of MDSCs in tuberculosis patients

2.2 MDSC频率与Th1的百分比呈负相关在HC中检测到较低水平的IFN⁃γ或产生IL⁃17的CD4+T细胞。同时，在M.tb肽刺激后MDSCs的百分比显著降低。MDSCs百分比与结核病患者Th1频率成反比。见图2。

2.3 GM⁃csf和IL⁃6诱导的CD33+HLA⁃DRlow细胞抑制T细胞增殖功能性CD33+MDSC样细胞是HLA⁃DR+细胞而不是 HLA⁃DR⁃细胞。当与 HLA⁃DR高单核细胞比较时，CD33+HLA⁃DR+MDSC样细胞几乎是HLA⁃DR低表型。与配对的CD33+HLA⁃DR细胞相比，GM⁃csf和IL⁃6诱导的CD33+HLA⁃DRlow细胞能够以剂量依赖的方式抑制自体T细胞的增殖。见图3。

2.4 IFN⁃γ受体CD33+HLA⁃DRlow MDSCs表现出抑制功能下降GM⁃csf和IL⁃6诱导的CD33+HLA⁃DRlowMDSC与相应的IFN⁃γ受体化的MDSC相比，具有更强的抑制自体T细胞的能力。而CD33+HLA⁃DR-细胞显示非抑制活性。与细胞因子诱导的CD33+HLA⁃DRlowMDSC共培养后，分析自体CD3+T细胞上CD69，CD25和HLA⁃DR的活化标志物的表达。IFN⁃γ-培养的CD33+HLA⁃DRlowMDSC抑制T细胞活化程度较低，而GM⁃csf和IL⁃6诱导的CD33+HLA⁃DRlowMDSC显著抑制自体T细胞的活化。见图4。

图2 MDSC频率与Th1在TB患者中呈负相关Fig.2 MDSCfrequency was negatively correlated with Th1 in TBpatients

图3 IFN⁃γ教育抑制CD33+HLA⁃DRlow MDSC抑制T细胞增殖Fig.3 IFN⁃γ educate inhibition CD33+HLA⁃DRlow MDSCinhibition of T cell proliferation

细胞内流式细胞术分析表明，受IFN⁃γ培养的CD33+HLADRlowMDSC在较小程度上阻碍产生IFN⁃γ的 CD4+T，而 GM⁃csf和 IL⁃6诱导的 CD33+HLA⁃DRlowMDSC显著抑制CD4+T细胞中的IFN⁃γ产生。此外，GM⁃csf和IL⁃6诱导的CD33+HLA⁃DRlowMDSCs与IFN⁃γ⁃受体相比诱导更高水平的FoxP3+CD4+T细胞。

3 讨论

MDSCs与人类结核感染的进展密切相关，MD⁃SCs在活动性结核病患者以及LTBI患者的外周血中均有扩增［4-6］。此外，药物治疗减少了MDSC的积累。有证据表明MDSCs可以作为结核病治疗反应的标志物。有趣的是，最近接触结核病的结核菌素皮试（TST）（+）个体中MDSC的频率高于远程接触结核病。活动性结核病患者的MDSC比具有LTBI的患者具有更广泛的抑制作用。MDSCs的蓄积和功能与病原菌的加载或炎症微环境有关。MDSC功能与病原体负载无关，尽管它们能够摄取M.tb。鉴于MDSCs有较高可塑性，笔者设想在M.tb慢性炎症过程中微环境中的免疫介质可影响MDSCs的积累和功能。具有潜伏感染的个体通常获得有效的T细胞应答保护，而患有活动性结核病，晚期或播散性疾病的患者缺乏有效的T细胞免疫［7-9］。同抑制效应T细胞反应与活跃性结核或播散性疾病中MDSCs的旺盛扩增有关［10］。本研究显示，MDSCs的扩增与IFN⁃γ+CD4+T细胞呈负相关。众所周知MDSCs能够抑制IFN⁃γ+CD4+T细胞的产生。

图4 IFN⁃γ教育抑制CD33+HLA⁃DRlow MDSCs抑制T细胞活化Fig.4 IFN⁃γ educate inhibition CD33+HLA⁃DRlow MDSCs from inhibiting Tcell activation

IFN⁃γ最近被认为是MDSC扩增和小鼠免疫抑制功能的基本分子［11-12］。一方面，据报道，IFN⁃γ通过降低抗凋亡蛋白Bcl2a的表达负调节粒细胞-MDSC的存活，并连续抑制粒细胞-MDSC的抑制功能，阻断IFN⁃γ直接损害单核细胞-MDS的抑制功能［13-15］。另一方面，在具有 IFN⁃γ-或 IFN⁃γR-/-肿瘤的小鼠中，MDSC的表型，积累和抑制功能与来自野生型小鼠的相似物类似，表明IFN⁃γ不是MDSC的关键调节剂。表明IFN⁃γ处理将人肿瘤相关巨噬细胞（TAM）从免疫抑制转变为免疫刺激细胞并阻止TAM从其前体产生。到目前为止，关于IFN⁃γ对人MDSC的影响知之甚少。来自健康个体的IFN⁃γ-培养的CD33+HLA⁃DRlowMDSC比GM⁃csf和IL⁃6-诱导的CD33+HLADRlowMDSC具有更少的抑制性质，作为T细胞活化，增殖和IFN⁃γ产生的恢复以及Treg诱导减少的证据。故IFN⁃γ抑制了人类MDSCs的抑制功能。由GM⁃csf和IL⁃6诱导的MDSC产生的免疫抑制的唯一子集是CD33+HLA⁃DRlow细胞群，和CD33+HLA⁃DR-细胞完全没有抑制活性。抑制性活动可能不是MDSCs的稳定特征，而是暂时的状态，这将由MDSCs迁移的微环境中的本地信号改变。

图5 IFN⁃γ教育抑制CD33+HLA⁃DRlow MDSC抑制Th1应答并且促进Treg扩展Fig.5 IFN⁃γ educate inhibition CD33+HLA⁃DRlow MDSCinhibitis of Th1 responses and promotes Treg expansion

本研究表明，CD33+HLA⁃DRlowMDSC的免疫抑制活性通过阻断PD⁃1而显著减少，CD33+HLA⁃DRlowMDSC的免疫抑制功能是PD⁃1/PD⁃Ls途径依赖性的。然而，PDL1在细胞因子诱导的MDSC中的可比较的表达水平不能支持PD⁃L1在受IFN⁃γ培养的抑制性较弱的MDSC上的作用。PD⁃L1的中和不会消除未治疗的慢性淋巴细胞性白血病患者外周血中PD⁃L1hiCD11b+CD33+CD14+HLA⁃DR1单核细胞MDSCs的免疫抑制功能。值得注意的是，尽管PD⁃L1可能是显性负抑制分子，但PD⁃L2被认为是可能的第二重要抑制分子。PD⁃L2与PD⁃1的相对亲和力高于PD⁃L1，因此如果PD⁃L1在相同水平上表达，PD⁃L1与PD⁃L1结合的能力会超出PD⁃L1。因此，与IFN⁃γ-受教育的CD33+HLA⁃DRlowMDSC相比，更高水平的PD⁃L2负责GM⁃csf和IL⁃6诱导的CD33+HLA⁃DRlowMDSC更强的抑制功能。

综上所述，MDSCs的积累与TB的疾病进展有关。此外，M.tb感染诱导了一个适当的微环境来驱动MDSCs的积累，其抑制适应性免疫反应以促进持续感染。而且，产生IFN⁃γ的细胞通过抑制细胞-细胞接触介导的免疫抑制来抑制MDSC的抑制活性，从而增强了抗分枝杆菌反应以控制疾病进展。