ERK5在小鼠骨质疏松性骨折愈合过程中作用的实验研究

盛晓赟 郭来威 闫亮 万浪 姜金 夏亚一,*

1. 兰州大学第二医院关节外科，甘肃 兰州 7300002. 甘肃省骨关节疾病研究重点实验室，甘肃 兰州 730000

骨骼是人体内具有生物活性的重要组织器官，它具有负重、参与运动、支撑、保护内脏器官及存储矿物质等众多生理功能，并与身体力学特性密切相关。骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以全身骨含量减少，骨的微结构破坏，骨组织相关蛋白种类及含量改变，从而导致骨组织缺乏、骨密度(bone mineral density，BMD) 减低、骨骼脆性增加，进而引起骨痛、骨折风险增高的一种慢性代谢性骨病[1-2]。OP及由其引起的病理性骨折已发展为世界上患病率最高、医疗费用消耗最大的慢性基础性疾病之一[3]。

ERK5是MAPK信号通路家族的重要成员，可被各种应激刺激(高渗刺激、低氧刺激、应力刺激等)所激活[4]，从而使磷酸化ERK5高表达，进而促进骨钙蛋白(osteocalcin，OCN)、骨桥蛋白(osteopontin，OPN)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、成骨相关转录因子2(runt-related transcription factor 2，Runx2)等成骨相关蛋白活性及表达增加；而ERK5的活性被抑制剂阻断后，成骨细胞ALP活性、OCN、OPN和Runx2表达明显被抑制[5]。而由于目前尚无特异性ERK5体内激动剂，因此通过ERK5特异性阻断剂XMD8-92在体研究ERK5与成骨细胞增殖和分化及骨骼组织的成骨作用，对于探索新的措施预防和治疗骨质疏松及骨质疏松性骨折的发生具有重要意义[6]。

1 材料和方法

1.1 实验材料

健康成年昆明系雌性小鼠，6周龄，SPF级别，体重(20±2)g，购于甘肃省中医药大学实验动物中心，实验单位使用许可证号：SYXK(甘)2015-0005。

1.2 实验方法

1.2.1实验分组：将108只小鼠采用随机数字表法将其随机分为4组：正常单纯股骨骨折组(Fracture组)、正常骨折+腹腔注射XMD8-92组(Fracture+XMD8-92组)、骨质疏松+骨折组(OVX+Fracture组)、骨质疏松+骨折+腹腔注射XMD8-92组(OVX+Fracture+XMD8-92组)，每组各27只小鼠。

1.2.2模型建立：(1)骨质疏松模型构建。通过切除小鼠双侧卵巢，并定期检测小鼠BMD值来构建骨质疏松动物模型。(2)股骨骨折模型构建。OVX组小鼠BMD值下降达到要求后，使用2%戊巴比妥钠溶液，5 mL/kg麻醉各组小鼠，麻醉满意后于超净工作手术台上，小鼠取仰卧位固定四肢，常规备皮、消毒，于小鼠右股骨外侧行0.5 cm纵行切口，暴露股骨中段，用剪刀剪断造成股骨中段横行骨折，然后自髌骨旁内侧小切口，暴露股骨髁，由髁间窝处将14号尖针逆行植入髓腔，作为髓内固定针固定骨折断端，检查骨折断端固定良好后缝合切口。

1.2.3实验处理及术后护理：小鼠股骨骨折术后室温(22 ℃～24 ℃)苏醒恢复活动后，XMD8-92处理组小鼠腹腔注射ERK5特异性阻断剂XMD8-92，50 mg/kg[7-8]，连续注射4 w，其余两组小鼠以同法于腹腔注射同等量生理盐水，清洁环境下单笼饲养；术后3 d自由给水及饮食，并定时对手术切口局部注射青霉素钠预防伤口感染，3 d后适度限制饮食控制体重。

1.3 实验标本采集

实验小鼠自建立股骨骨折模型术后第1、2、4周后分别随机选取该组实验小鼠总数的1/3，并颈椎脱臼法处死，用于后续实验结果检测。

1.4 检测方法

1.4.1X线检查：各实验组小鼠分别随机选取3只，行术侧股骨X线片拍片检查，观察股骨骨折断端骨折愈合及骨折端骨痂生长情况。

1.4.2微计算机断层扫描(micro computed tomography，micro-CT)检查：各组分别随机选取3只小鼠，将术侧股骨标本小心取下，对术侧股骨标本行micro-CT扫描及3D重建检查，比较股骨骨折水平骨折愈合及骨痂中骨小梁的微结构差异。

1.4.3HE染色检查：各组分别随机选取3只小鼠，将术侧股骨标本小心取下，剔除股骨上附着的肌肉组织，置于4%的多聚甲醛中固定。然后使用10%中性福尔马林溶液100 mL加EDTA 5.5 g配置的溶液浸泡标本进行脱钙，以尖针扎入股骨标本的难易度定期检查脱钙是否完成。脱钙完成后使用浓度梯度酒精对标本脱水，然后用二甲苯溶液透明处理。透明完成后将股骨骨痂标本组织块置于溶化的石蜡中充分包埋并凝固成块，专用切片机进行切片，厚度约6 μm。然后用二甲苯脱蜡、水化，染色，最后用中性树胶封片，显微镜下观察。

1.4.4免疫组织化学染色检查：各组分别随机选取3只小鼠，将术侧股骨标本小心取下，股骨骨痂石蜡切片，60 ℃烤箱烘烤约120 min，然后用二甲苯、梯度酒精、PBS及蒸馏水脱蜡至水，高压处理抗原修复，PBS液漂洗10 min×3次，3% H2O2室温孵育30 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，再次用PBS漂洗10 min×3次，5%～10%正常山羊血清封闭，室温孵育30 min，分别加ALP、Runx2、ERK5一抗工作液，放于4 ℃冰箱过夜处理，再次PBS漂洗10 min×3次，滴加适量辣根酶工作液，室温孵育约2 h，PBS漂洗10 min×3次，DAB显色3～10 min，自来水冲洗，复染，脱水，透明，封片，显微镜下观察。

1.5 统计学处理

图1 术后小鼠股骨X线片。A：小鼠骨折术后第1周各组股骨X线片结果；B：小鼠骨折术后第2周各组股骨X线片结果；C：小鼠骨折术后第4周各组股骨X线片结果Fig.1 Femoral X-ray in postoperative mice. A: The results of femoral X-ray in each group after 1 week of fracture; B: The results of femoral X-ray in each group after 2 weeks of fracture; C: The results of femoral X-ray in each group after 4 weeks of fracture.

实验数据以均数±标准差表示，结果使用SPSS 19.0软件行统计学分析，各时间点的组间数据比较采用独立样本t检验，P<0.05时认为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 骨质疏松模型建立结果

小鼠骨质疏松模型建立前股骨BMD值平均为(0.11±0.01)g/cm2，此后每间隔一周复测一次BMD，至12 w时测得小鼠股骨BMD降至(0.08±0.00)g/cm2，降低了约27.3%(P<0.05)，证明小鼠骨质疏松模型建立成功。

2.2 X线检查结果

小鼠股骨骨折术后第1周，单纯Fracture组、Fracture+XMD组、OVX+Fracture组及OVX+Fracture+XMD8-92组股骨骨折处水平无明显骨痂生长，骨折端比较锐利，骨折线较明显，仍清晰可见(图1 A)。

小鼠股骨骨折术后第2周，单纯Fracture组股骨骨折线水平可见骨痂生长，包绕骨折断端周围，骨折线较模糊，Fracture+XMD组、OVX+Fracture组及OVX+Fracture+XMD8-92组骨折断端仍无明显骨痂生长，骨折断端仍较明显，骨折线仍清晰可见(图1B)。

小鼠股骨骨折术后第4周，单纯Fracture组股骨骨折线水平见骨痂进一步增多，包绕骨折断端周围及骨皮质，骨折线消失或模糊不清；而Fracture+XMD组和OVX+Fracture组骨折断端可见少量骨痂，骨折线较模糊，OVX+Fracture+XMD8-92组骨折断端骨痂生长更少，骨折断端略模糊或仍可见明显骨折线(图1C)。

2.3 micro-CT检查结果

小鼠股骨骨痂的Micro-CT扫描三维立体结构可以看出，XMD8-92处理会影响小鼠股骨骨折的骨痂生长，影响骨折断端的愈合，使骨痂结构变得疏松，尤其在骨折愈合的第2和第4周较明显(图2 A～C)。第1周时，各组均无明显骨痂生长，骨折端清晰可见，为避免增加系统误差影响实验的可靠性，未行骨痂BMD及骨微结构参数统计。第2周时，单纯Fracture组骨痂开始生长，包绕骨折断端，骨折线开始模糊。而Fracture+XMD组、OVX+Fracture组及OVX+Fracture+XMD8-92组骨折处仍无明显骨痂生长或仅有少量骨痂，骨折线仍较清晰，OVX+Fracture+XMD8-92组更为显著；与单纯Fracture组相比，Fracture+XMD组、OVX+Fracture组及OVX+Fracture+XMD8-92组的骨痂区BMD分别减少了约11.0%、13.7%和24.7%，而骨组织参数骨体积分数(bone volume fraction，BV/TV)分别减少了约50.5%、42.9%和64.5%，骨小梁数目(number of trabecular bone，Tb.N)分别减少了约52.9%、47.1%和76.5%，骨小梁厚度(thickness of trabecular bone，Tb.Th)分别减少了约52.9%、35.3%和70.6%，而骨小梁间隙(space of trabecular bone，Tb.Sp)分别增高了约150.0%、90.0%和250.0%(图2D～G)。第4周时，单纯Fracture组骨痂进一步增多，包裹骨折断端及其周围骨皮质，骨折线消失，骨痂骨小梁变得致密；Fracture+XMD组、OVX+Fracture组骨折断端骨痂较少，骨折断端较模糊，骨痂骨小梁较少而疏；而OVX+Fracture+XMD8-92组骨折端骨痂则更少，骨折线较清晰，骨痂骨小梁更为稀少且疏松。与单纯Fracture组相比，XMD8-92处理后的Fracture+XMD组BMD、BV/TV、Tb.N、Tb.Th分别降低了约29.8%、30.3%、39.3%和30.8%，而Tb.Sb增高了约162.5%。由此表明，腹腔注射XMD8-92可以抑制小鼠骨折愈合过程中骨痂生长，减低骨痂BMD值及骨小梁数目。另外，OVX+Fracture+XMD8-92组与OVX+Fracture组相比，则具有更低的BMD(-13.9%，P<0.05)、BV/TV(-38.3%，P<0.05)、Tb.N(-55.6%，P<0.05)、Tb.Th(-54.5%，P<0.05)，具有更高的Tb.Sb(82.4%，P<0.05)(图2H～K)。这表明XMD8-92能够影响小鼠骨质疏松性骨折的愈合过程，抑制骨痂生长，降低骨小梁厚度及数目，使骨痂微结构变得更为疏松。

图2 术后小鼠股骨骨痂的Micro-CT 扫描及3D重建结果。A～C：小鼠股骨冠状层面及重建扫描结果(A、B、C分别为第1、2、4周结果)；D～K：骨痂骨小梁各指标定量分析结果(D～G为第2周结果；H～K为第4周结果)。BV/TV：骨体积分数，Tb.N：骨小梁数目，Tb.Th：骨小梁厚度，Tb.Sp：骨小梁间隙。*表示两者间比较差异有统计学意义(P<0.05，n=3)Fig.2 Micro-CT scan and 3D reconstruction of femoral callus in postoperative mice. A-C: The femoral coronal plane scan and reconstruction results in mice at the 1st (A), 2nd (B), and 4th (C) week; D-K: Quantitative analysis of trabecular bone in the bone callus (D-G: the results of the 2nd week; H-K: the results of the 4th week). BV/TV: bone volume fraction, Tb.N: number of trabecular bone, Tb.Th: thickness of trabecular bone, Tb.Sp: space of trabecular bone. * Indicates a statistically significant difference between the two groups (P<0.05, n=3).

2.4 HE染色结果

第1周各组骨折处骨痂骨量较少且骨小梁生长无明显差异。第2周可见单纯Fracture组骨痂量及骨小梁较其他3组增多，而OVX+Fracture组与OVX+Fracture+XMD8-92组相比，骨小梁生长均较少且差异不明显。第4周可见Fracture+XMD组、OVX+Fracture组及OVX+Fracture+XMD8-92组骨折端骨痂的量及骨小梁较单纯Fracture组少，骨小梁菲薄；且与OVX+Fracture组相比，OVX+Fracture+XMD8-92组骨痂的量及骨小梁数目则更为稀少且菲薄(图3)。

图3 术后小鼠股骨骨痂的HE染色结果。A：第1周各组骨痂及骨小梁的结果；B：第2周各组骨痂及骨小梁的结果；C：第4周各组骨痂及骨小梁的结果Fig.3 HE results of postoperative femoral callus in mice. A: The results of callus and trabecular bone in the first week; B: The results of callus and trabecular bone in the second week; C: The results of callus and trabecular bone in the fourth week.

2.5 免疫组织化学染色结果

第1周各组骨痂标本中ALP表达量无明显差异(P>0.05)，但ERK5、Runx2的表达OVX+Fracture+XMD8-92组却低于其他3组(P<0.05)(图4 A、D)。第2周可见单纯Fracture+XMD组的ERK5、ALP、Runx2表达较其他3组高(P<0.05)，且OVX+Fracture组各蛋白表达均高于OVX+Fracture+XMD8-92组(P<0.05)(图4 B、E)。第4周可见Fracture+XMD组、OVX+Fracture组及OVX+Fracture+XMD8-92组骨折端骨痂中ERK5、ALP、Runx2表达较单纯Fracture组少(P<0.05)；且与OVX+Fracture组相比，OVX+Fracture+XMD8-92组ERK5、ALP、Runx2表达则更少(P<0.05，图4 C、F)。

3 讨论

骨质疏松症与高血压、糖尿病、肿瘤及动脉粥样硬化共同被称作是当前的5大严重慢性疾病。BMD检查是目前医疗界诊断OP的“金标准”，并可以通过该检查预测骨质疏松性骨折发生风险的高低，可以作为OP病程检测及治疗药物疗效评价的简单而准确的定量指标[9-10]。骨的强度大小与BMD和骨含量有关，而骨强度的大小约70%是由BMD决定的[11-13]，当BMD值降低1个标准差时，骨强度的降低引起骨折风险将增加1.5～2.6倍[14]。OP患者的骨组织显微结构显示成骨细胞功能明显减弱，而破骨细胞数量增多，功能活跃，进而导致骨丢失增多，骨的形成明显减少，骨小梁数目减少，厚度变薄，骨小梁间距增宽，其抗应力能力下降，因而极易导致微骨折的发生。

ERK5是MAPK信号通路家族的重要成员[15]，可被各种应激刺激(高渗刺激、低氧刺激、应力刺激等)所激活[4]，激活后的ERK5可进一步刺激下游多种转录因子信号的表达，其中最常作用于肌细胞增强因子(myocyte enhancer factor，MEF)家族中的MEF2A,C,D位点[16-18]，进而参与细胞相应的信号转导及调控。而ERK5的这些上下游信号通路可被多种抑制剂如BIX02188、BIX02189以及ERK5特异性抑制剂XMD8-92所干扰阻断[8，19-20]，因而提供了ERK5信号转到通路上特定的可控作用靶点。

ALP是成骨细胞早期活性指标，属于早期的成骨相关性蛋白，可在成骨细胞增殖及分化早期检测到[21-24]。Runx2是成骨分化过程中一个非常重要的转录因子，可调节ALP、OCN、OPN等基因转录和表达[25]，进而发挥成骨作用。实验研究显示，流体剪切力(fluid shear stress，FSS)可以刺激并激活成骨细胞ERK5信号通路，使磷酸化ERK5高表达，进而调节成骨细胞增殖与分化功能，参与成骨作用[19，26-28]。间歇性的FSS施于成骨细胞后，刺激ERK5高表达并发生磷酸化，增强ALP、OCN、OPN活性及表达增加；而ERK5的活性被抑制剂阻断后，成骨细胞ALP活性、OCN、OPN和Runx2表达明显被抑制[5]。由此可见，ERK5与成骨细胞增殖和分化及骨骼组织的成骨作用密切相关。

图4 术后小鼠股骨骨痂的免疫组织化学染色结果。A～C：分别为第1、2、4周小鼠骨痂免疫组化染色中ERK5、ALP、Runx2的表达结果；D～F：分别为第1、2、4周小鼠骨痂免疫组化染色中ERK5、ALP、Runx2的表达量以光密度转换为具体数值行定量分析的结果。*表示两者间比较差异有统计学意义(P<0.05，n=3)Fig.4 Immunohistochemical staining results of postoperative femoral callus in mice. A-C: Immunohistochemical staining of the expression of ERK5, ALP and Runx-2 in callus at the 1st, 2nd and 4th week, respectively; D-F: Quantitative analysis of the expression of ERK5, ALP and Runx-2 in callus.* Indicates a statistically significant difference between the two groups (P<0.05, n=3).

本实验将通过切除小鼠双侧卵巢(OVX)来构建骨质疏松动物模型，通过OVX术前测量BMD值作为骨密度的起始值，行OVX术后12 w小鼠股骨BMD值较术前降低明显，差异有统计学意义，证明通过切除小鼠双侧卵巢构建绝经后骨质疏松动物模型是可行的。然后分别构建小鼠正常股骨骨折模型、骨质疏松股骨骨折模型，并通过给小鼠腹腔注射ERK5特异性阻断剂XMD8-92，可以发现XMD8-92使正常骨折骨痂形成速度减慢，且通过Micro-CT及HE染色结果可以观察到，腹腔注射XMD8-92组小鼠，股骨骨折端骨痂变薄疏松，骨小梁数目减少，骨小梁较纤细且紊乱，这与X线片显示的注射XMD8-92组小鼠股骨骨折端愈合差于单纯骨折组相一致。另外，骨质疏松性骨折模型组小鼠骨痂形成则更为缓慢，同样通过Micro-CT及HE染色结果可以看到，腹腔注射XMD8-92的骨质疏松组小鼠，股骨骨折端骨痂更加稀少菲薄，骨小梁数目极少，骨小梁细长且极其紊乱；而且通过X线片结果也可更直观地看到骨质疏松性骨折加腹腔注射XMD8-92组小鼠股骨骨折愈合相比其他各组明显减慢且愈合明显较差。可见，XMD8-92的阻断抑制作用可进一步抑制骨质疏松性骨折的成骨过程，影响骨折愈合。另外，通过小鼠股骨骨痂标本免疫组织化学染色，结果显示XMD8-92处理组ERK5活性及表达减低，ERK5下游多种转录因子信号的合成及表达受阻，进而使成骨相关蛋白产物ALP、Runx-2的表达量也随之减低；且骨质疏松性骨折+XMD8-92组与单纯骨质疏松+骨折组相比，ERK5活性及ALP、Runx-2表达更低，进而严重阻滞了小鼠股骨骨折端成骨过程，使骨小梁的正常爬行生长秩序被打乱，骨小梁形成受阻，从而表现为骨折端骨痂生成的质和量明显受限。可见，阻断ERK5后，骨质疏松性骨折成骨相关蛋白表达受阻，骨小梁生成障碍，骨痂生长的速度和质量减低，从而阻碍了骨折愈合的宏观过程。

由此可见，ERK5参与骨折愈合过程成骨相关蛋白的合成表达，影响骨痂形成的速度和质量，参与调控小鼠股骨骨折的早期愈合。因此，ERK5在促进骨质疏松性的骨折愈合过程中起着十分重要的生理作用，但ERK5具体通过何种方式、何种信号通路调控骨质疏松性骨折的愈合过程，以及ERK5与成骨形成过程中其他信号通路间是否具有协同或相互制约关系，并达到怎样的平衡来共同调节成骨及骨质疏松骨折愈合，有待进一步的探索及实验研究来证实。