中药复方鹿角胶丸通过PI3-K/AKT信号通路调节破骨细胞凋亡

于冬冬 赵丹阳 姚啸生

1. 辽宁中医药大学附属医院，辽宁 沈阳 1100322. 沈阳市第一人民医院神经内科，辽宁 沈阳 110032

糖皮质激素性骨质疏症(GIOP)是临床的常见病、多发病，其发病机制目前还不清楚。研究发现，GIOP中破骨细胞的凋亡受到抑制[1]。

中医理论认为“补肾填精壮骨法”是治疗骨质疏松症根本治法，其中《太平圣惠方》中的“鹿角胶丸”具有促进骨形成、抑制骨吸收[2]、防治骨质疏松症之功效[3]。同时，本研究者在临床工作中使用中药复方鹿角胶治疗糖皮质激素性骨质疏松症患者，收获很好的临床疗效。

因此，本研究在中医理论的基础上，从破骨细胞凋亡调节机制入手，应用分子生物学技术，研究中药方剂鹿角胶丸能否调节破骨细胞凋亡，为其临床防治糖皮质激素性骨质疏松症提供理论依据。

1 材料和方法

1. 1 材料

1.1.1实验动物及细胞：SPF级SD雌性大鼠24只，体质量 300± 10 g，按随机数字表法分为4组各6只，以制备含药血清，大鼠均由辽宁长生生物技术有限公司提供(许可证号 SCXK(辽)2015-0001)。

1.1.2药物及试剂：本实验中药饮片均在辽宁中医药大学附属医院购买。中药复方鹿角胶丸组成：由鹿角胶3 g，附子10 g，肉桂5 g，杜仲10 g，山茱萸10 g，菟丝子12 g，熟地黄10 g，肉苁蓉10 g，五味子5 g，牛膝10 g，巴戟天5 g。将药制备为水煎剂，生药量为1 g/mL。

小鼠单核巨噬细胞RAW264.7细胞(ATCC，美国)，sRANKL(Peprotech，美国)，M-CSF(Peprotech，美国)，DMEM(Hychone，美国)，进口胎牛血清(Hychone，美国)，细胞凋亡检测试剂盒(碧云天，中国)，Bax、Bcl-2、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3、p-AKT、T-AKT(CTS，美国)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(CTS，美国)。

1.1.3仪器：细胞孵箱(Thermo，美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；流式细胞仪(BD，美国)；AMR-100酶标仪(杭州奥盛仪器有限公司，中国)。

1.2 实验方法

1.2.1含药血清制备与实验分组：24只大鼠按随机数字表法分为空白对照组、中药复方鹿角胶丸(LJJW高、中、低)组，6只/组。以每 kg体重大鼠的给药量为正常人给药量 6. 3倍，每次大鼠给药量以正常人给药量的LJJW高(3倍等效量)、LJJW中(等效量)、LJJW低(1/3等效量)倍计算，计算后为7.29、2.43、0.81 g/kg体重，LJJW高浓度组加水煎致4 mL液体量，其他组根据比例进行稀释，每日灌服2次，每次灌服2 mL，空白对照组灌服等体积的蒸馏水。第4天早晨给药2 h后麻醉，腹主动脉取血后静置2 h，离心(2 500 r/min，4 ℃，20 min)后收集血清，56 ℃浴灭活30 min后分装，-86 ℃保存。

1.2.2小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.7培养及诱导分化：未分化的小鼠单核/巨噬细胞RAW 264.7，培养在DMEM培养基(含10%胎牛血清，不含抗生素，37 ℃，5%CO2)。细胞接种于6孔板内，细胞密度1×104/孔，24 h后换成诱导分化培养液培(DMEM培养基，含10%胎牛血清、20ng/mL RANKL、20ng/mL M-CSF)继续培养5 d。

1.2.3MTS检测细胞增殖活性：细胞分对照(Control)、鹿角胶丸高、中、低浓度组(LJJW高、中、低)。细胞平铺(5×103细胞/孔)96孔平板中，24 h后更换分化培养基(药物处理组的血清终浓度为15%)，细胞经处理3、12、24、48、72 h后，每孔加20 μL CellTiter 96© AQueous One Solution Reagent。在37℃，5% CO2的细胞培养箱中孵育1 h。490 nm读取吸光度值。OD值=(处理后细胞OD值-对照组细胞OD值/N)，n>3。

1.2.4流式细胞仪检测：细胞分Control、LJJW(中)、LY294002、LJJW(中)+LY294002组。收取细胞后PBS洗涤，细胞重悬于195 μL结合缓冲液。避光与5 μL Annexin V FITC和PI 10 μL 在25℃孵育15 min。孵育后加入300 μL结合缓冲液进行流式细胞仪分析n>3。

1.2.5Western Blot检测：细胞分Control、LJJW、LY294002、LJJW+LY294002组。细胞加入裂解液提取蛋白，BCA法定量蛋白。取20 μg蛋白样品，于10%聚丙烯酰胺凝胶上行SDS-PAGE电泳，电泳结束后100 V电转印至PVDF膜上。37 ℃封闭1 h、一抗4 ℃孵育过夜。辣根过氧化物酶(HRP)标记的稀释二抗孵育，ECL发光法曝光成像，扫描入电脑，n>3。Image J软件测定平均灰度值。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 鹿角胶丸抑制破骨细胞增殖活性

MTS方法对破骨细胞增殖活性进行检测(图1)，结果显示，各个浓度的鹿角胶丸(LJJW高、中、低)均能抑制破骨细胞的增殖活性(P<0.05，与对照组相比较)，其中以LJJW(中浓度)作用24 h后具有较大的增殖活性抑制作用。因此LJJW(中浓度)及24 h作为实验用药浓度及作用时间。

图1 鹿角胶丸抑制破骨细胞增殖Fig.1 Antler pill inhibited proliferation of osteoclasts

图3 鹿角胶丸促进破骨细胞凋亡Fig.3 Antler pill promoted apoptosis of osteoclasts

2.2 破骨细胞的形态学观察

倒置相差显微镜观察细胞形态(图2)，对照组的破骨细胞呈圆形，透光度好，边界清晰，无触角，贴于培养瓶底部。加入鹿角胶丸后，细胞明显老化，可见触角，细胞略呈短梭形，细胞透光度下降，紧密贴附于瓶底，凋亡细胞皱缩，漂浮于培养基中。诱导分化培养基诱导细胞融合，最后形成巨大的多核破骨细胞。

图2 形态学观察鹿角胶丸促进破骨细胞凋亡Fig.2 Morphological observation of osteoclast apoptosis promoted by antler pill

2.3 LJJW通过PI3K/AKT通路抑制破骨细胞凋亡

流式细胞仪检测结果显示鹿角胶丸促进破骨细胞凋亡(图3)，对照组细胞的凋亡率为1.20%±0.05%，加入鹿角胶丸后破骨细胞的凋亡增加达8.50%±0.15%(P<0.01，与对照组相比较)，单独加入PI3K/AKT抑制剂LY294002后对破骨细胞的凋亡影响不明显1.00%±0.04%(P>0.05，与对照组相比较)，预处理LY294002，鹿角胶丸的促细胞凋亡作用受到抑制，细胞凋亡率为3.00%±0.16%(P<0.05，与对照组相比较)。

2.4 Westerm Blot结果

图4 A 鹿角胶丸促进Bcl-2表达，抑制Bax、Caspase3表达Fig.4 A Antler pill promoted the expression of Bcl-2 and inhibited the expression of Bax and Caspase3

图4 B 鹿角胶丸促进AKT磷酸化Fig.4 B Antler pill promoted the phosphorylation of AKT

图4 C 蛋白电泳量化图Fig.4 C Quantitative electrophoresis of the protein

进一步分析鹿角胶丸促进破骨细胞凋亡的潜在机制(图4 A、B、C)，免疫印迹结果显示，鹿角胶丸促进线粒体Bax表达，抑制Bcl-2的表达，同时促进Caspase-3的裂解(P>0.05，与对照组相比较)。同时通路蛋白显示，鹿角胶丸促进AKT磷酸化，加入PI3K/AKT通路抑制LY294002后AKT的磷酸化受到抑制，预处理LY294002后加入鹿角胶丸，鹿角胶丸的促AKT磷酸化作用被抑制(P>0.05，与对照组相比较)。

3 讨论

研究发现GIOP中成骨细胞分化受抑制、凋亡增加[4]，我们前期研究发现葛根素抑制糖皮质激素诱导的成骨细胞凋亡[5]。Shi等[1]发现，糖皮质激素激活RANK-RANKL-OPG 系统，通过增加RANKL配体表达并减少OPG的表达，刺激破骨细胞分化，抑制破骨细胞的凋亡而导致骨吸收增加。因此，若应用能够促进破骨细胞凋亡的药物，对于临床防治GIOP具有重要的意义。

《太平圣惠方》中记载“鹿角胶丸”，由鹿角胶、附子、桂心、杜仲、山茱萸、菟丝子、熟地黄、肉苁蓉、五味子、牛膝、巴戟天组成。功效益肾补骨。方用鹿角、菟丝子等温肾壮阳，熟地、附子滋阴填精，山茱萸、牛膝等，具有温阳益阴、强筋壮骨的作用，在温补肾阳的同时能健脾益气、滋肾阴、养肝血，标本兼治。动物模型研究发现，鹿角胶丸具有促进骨形成、抑制骨吸收的药效学作用[2,3]，但具体的分子机制还不清楚。研究发现，多种中药活性成分作用于破骨细胞，促进其凋亡，如根皮素、柚皮苷等[6,7]。因此，我们从中药鹿角胶丸调节破骨细胞为切入点，探讨其防治GIOP的潜在机制。

PI3-K/Akt通路作为细胞内非常重要的信号转导途径，在细胞的生长、凋亡等过程中发挥着极其重要的生物学功能。研究发现，PI3-K/ Akt信号通路参与人破骨细胞凋亡调节[8]。线粒体是细胞凋亡调节的关键部位，能够合成释放一系列的抗凋亡及促凋亡因子，其中Bcl-2家族蛋白是抗细胞凋亡的关键因子，Bax是促进细胞凋亡的关键因子。Bcl-2能够与Bax结合并抑制细胞的凋亡。研究发现Bcl-2-Bax复合体与破骨细胞凋亡调节密切相关[9]。我们研究发现中药复方鹿角胶丸能够通过PI3-K/Akt信号通路促进破骨细胞凋亡，在调节破骨细胞凋亡的过程中中药复方鹿角胶丸通过调节Bcl-2-Bax复合体，促进Bcl-2的表达，抑制Bax的表达，抑制Caspase3的裂解。

中医学认为，糖皮质激素为外源性“纯阳”之品。生理情况下，人体分泌生理剂量的糖皮质激素主要参与人体的正常工作机制，以保证阳气发挥“阳者卫外而为固也”的作用，以维持脏腑各种生理功能。若大剂量糖皮质激素使用日久，元阳之气如不敷出，过度外出而不潜降、内入、收藏，穷必及肾，终致肾之“封藏”失司，耗伤肾阴，最终导致阴阳俱虚。

目前研究骨质疏松症的发病机理虽然较多，但是基于PI3-K/AKT信号通路，从破骨细胞凋亡作为研究的切入点，探索中医药对破骨细胞凋亡的影响及机制的相关研究较少。因此，本研究对于中医药临床防治糖皮质激素性骨质疏松症有一定的意义。