海南黄芩中汉黄芩素抗肿瘤活性研究

刘洁，李备，刘春，陈露，梁扬，周玦飞，陈赞民

1.海南省药品检验所，海南 海口 570216；2.海南省食品检验检测中心，海南 海口 570311

肿瘤是指机体在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物，因为这种新生物多呈占位性块状突起，也称赘生物。肿瘤的治疗一直是世界难题，尽管市场上有多种药物，但由于其不良反应，导致对新药的需求一直处于饥渴状态。

唇形科（Labiatae）黄芩属（Scutellaria）植物资源十分丰富，全世界共有300余种。该属物种多具有清热燥湿、泻火解毒之功效[1-2]。黄芩属植物具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、保肝、抗氧化等活性。现代化学成分研究表明，黄酮和二萜为其主要活性成分[3]。海南黄芩（S.hainanensis）分布于海南地区，长于石山上，是海南特有植物，具有清热解毒的功效[4]。我们用多种提取分离技术获得黄芩中的汉黄芩素，并利用核磁共振（NMR）等技术对其结构进行鉴定；采用肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌等常见肿瘤细胞，利用MTT法测定汉黄芩素的细胞毒活性；采用S180移植的荷瘤小鼠，对汉黄芩素进行体内肿瘤实验。结果表明汉黄芩素有很强的抗肿瘤活性，这为深入研究与开发海南黄芩提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

海南黄芩于2014年8月采自海南省霸王岭；BLAB/c小鼠（北京维通利华动物有限公司）；宫颈癌HeLa细胞、肝肿瘤HepG2细胞、肺癌A549细胞（ATTC）；乳腺癌4T1细胞（中国医学科学院基础所细胞中心）；紫杉醇（PTX）注射液（海口市制药厂有限公司）。

Bruker AVⅢ600型核磁共振仪；RE-52A型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；岛津LC-10AD二元低压半制备液相色谱仪；HiChrom Apollo C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；Agilent半制备色谱柱（Phenyl，2.5 mm×25.0 cm，5 μm）；智能生化培养箱（丙林，SPX系列）；岛津20A高效液相色谱仪；薄层色谱预制板（青岛海洋化工厂）；柱色谱硅胶（100～200目，200～300目，青岛海洋化工厂）；Sephadex LH-20（Healthcare公司）；RPMI 1640完全培养基（Sigma公司）。

1.2 提取黄酮类化合物

干燥粉碎后的海南黄芩（5 kg）用95%乙醇（20 L）冷浸24 h，然后采用加热回流方式提取，共提取3次，每次2 h。减压回收溶剂，直至乙醇味消失。母液加水后用石油醚萃取，继而采用氯仿萃取，浓缩后得到50 g浸膏。

1.3 分离纯化黄酮类化合物

将氯仿萃取物进行硅胶柱色谱分析，采用氯仿-丙酮梯度洗脱，经合并后得到洗脱物Fr.A～Fr.C。Fr.C通过硅胶柱色谱、凝胶柱色谱、反相高效液相制备色谱得汉黄芩素（9.0 mg）。

1.4 测定黄酮类化合物纯度

称取5个化合物各约2 mg，精密称定，分别至100 mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，即得供试品。

采用HiChrom Apollo C18色谱柱，流动相A为0.3%磷酸，流动相B为甲醇∶乙腈=2∶3，流动相A∶流动相B=40∶60，流速1.0 mL/min，柱温35℃，进样量20 μL，检测波长280 nm。

1.5 核磁测定方法

采用Bruker AVⅢ600型核磁共振仪，溶剂为DMSO-d6，1H-NMR 为 600 MHz，13C-NMR 为 150 MHz。

1.6 活性成分足量制备

应用制备型高效液相色谱、高速逆流色谱或超临界流体色谱对活性显著的化合物汉黄芩素进行足量制备，储备用于动物实验的样品。

1.7 海南黄芩化学成分的细胞毒活性评价方法

汉黄芩素分别用溶剂DMSO溶解，体外抗肿瘤活性测定采用MTT法筛选体系，所有样品的抗肿瘤活性均使用宫颈癌HeLa细胞、肝肿瘤HepG2细胞、肺癌A549细胞进行实验。

1.7.1 细胞培养 常规方法培养，在底面积为25 cm2的培养瓶中加入RPMI1640完全培养基，含10%体积的新生牛血清、100 μg/mL链霉素和100 U/mL青霉素。细胞于37℃、5%CO2，相对湿度100%的恒温培养箱中进行培养。每日观察细胞生长状态，对生长密度超过80%瓶底面积的细胞进行消化传代。消化液用0.25%胰酶-0.02%EDAT，每次传代比例1∶3，以保证细胞一直处于对数生长期。

1.7.2 细胞接板 取对数生长期细胞，按5000～8000/孔接入96孔板，培养24 h后加药。

1.7.3 药物处理 用完全培养基梯度稀释药液，过滤除菌，加入96孔板中，200 μL/孔。每次实验设置6个空白对照孔（仅含完全培养基），药物浓度组设置1∶100、1∶500、1∶1000共3个梯度，每个梯度3个复孔。

1.7.4 MTT处理 将MTT溶于0.01 mol/L（pH7.4）的PBS缓冲液中，配成终浓度为5 mg/mL的溶液，0.22 μm滤膜过滤除菌。药物作用48 h后弃去培养液，PBS洗涤2次，加MTT溶液20 μL，继续培养4 h，弃去MTT溶液，PBS洗涤2次，用20 μL DMSO裂解细胞，溶解甲攒化合物。

1.7.5 测定及计算 用IC50计算软件计算半数抑制浓度。

1.8 海南黄芩中汉黄芩素体内抗肿瘤试验

1.8.1 肿瘤动物模型的建立 BALB/c小鼠，雌性，体重20±1 g，实验前饲养观察1周。培养4T1细胞至对数期，胰酶消化，用无菌生理盐水调整瘤细胞悬液浓度为1×106/mL，备用。BALB/c小鼠右腋下注射0.2 mL 4T1细胞悬液，肿瘤生长至第7 d，体积达到约100 mm3，筛选肿瘤大小相对一致的小鼠进行实验。

1.8.2 动物模型分组及给药 选择上述肿瘤模型动物32只，随机分成4组，阴性与阳性对照组每组10只，药物组每组6只。阴性对照组给予生理盐水，阳性对照组尾静脉注射10 mg/kg[5]市售紫杉醇（PTX）注射液；通过查阅文献[6]及预实验，药物低剂量组、药物高剂量组分别灌胃给予10、40 mg/kg海南汉黄芩素，连续7 d。

1.8.3 药效学指标考察 每次给药时称量小鼠体重，用游标卡尺测量小鼠肿瘤体积，每日观察小鼠毛发、活动、睡眠及死亡等一般状况。实验结束后，脱臼处死小鼠，完整剥离腋下肿瘤组织，称瘤重，计算抑瘤率（%）=（1-治疗组平均瘤重/阴性对照组平均瘤重）×100%。

2 结果

2.1 汉黄芩素结构鉴定

化合物为无色油状物，HPLC归一化法测得纯度为97.1%（图1）。根据化合物1H-NMR（600 MHz，DMSO-d6）谱（图2），推断δ：13.00（1H，s，5-OH），7.92（2H，t，J=8.4 Hz，H-2′，6′），7.52（3H，m，H-3′，4′，5′），6.50（1H，s，H-3），6.24（1H，s，H-8）。以上数据与文献[7]报道的汉黄芩素基本一致，故确定该化合物为汉黄芩素。

图1 汉黄芩素纯度测定液相色谱图

图2 汉黄芩素1H-NMR谱

2.2 海南黄芩化学成分抗肿瘤体外筛选结果

用IC50计算软件计算半数抑制浓度，结果显示海南黄芩中汉黄芩素对HepG2、HeLa和A549细胞均显示显著的抑制活性，IC50值依次为12.4±3.6、16.8±4.8、17.4±8.6 μmol/L。

2.3 海南黄芩中汉黄芩素体内抗肿瘤试验结果

2.3.1 肿瘤模型小鼠相对体重随时间变化曲线从结果看，实验期间阴性对照组模型小鼠体重逐步增加，阳性对照组模型小鼠在给予紫杉醇注射液后体重明显下降，而海南汉黄芩素低、高剂量组小鼠体重呈降低趋势，与阴性对照组相比存在明显差异（图3）。

图3 肿瘤模型小鼠相对体重随时间变化曲线

2.3.2 肿瘤模型小鼠随时间的生存曲线 阴性对照组小鼠在实验期间无死亡，阳性对照组小鼠在第6、7次给药后分别死亡1只，而海南汉黄芩素低、高剂量组小鼠均无死亡（图4）。这与小鼠相对体重曲线相一致，可能系阳性药紫杉醇注射液毒性大所致。

图4 肿瘤模型小鼠随时间的生存曲线

2.3.3 肿瘤模型小鼠相对肿瘤体积随时间变化曲线 从图5可见，阴性对照组肿瘤体积随时间推移明显增加；与阴性对照组相比，阳性对照组在给予紫杉醇注射液后，肿瘤体积的增加被明显抑制，尤其在给药后第4～7 d；低剂量汉黄芩素对小鼠肿瘤体积的增加表现出抑制趋势，但并不明显，而高剂量汉黄芩素则明显抑制肿瘤体积增加，在给药后第5～7 d差异明显，呈量-效关系。

图5 肿瘤模型小鼠相对肿瘤体积随时间变化曲线

2.3.4 肿瘤模型小鼠肿瘤重量变化情况 实验结束后处死小鼠，取出肿瘤（图6），称重。与阴性对照组比较，阳性对照组的肿瘤重量显著降低，抑制率达57%；海南汉黄芩素低、高剂量组小鼠的肿瘤重量均明显降低，抑制率分别为24%、54%（表1），且呈现出量-效关系。

图6 实验结束后肿瘤模型小鼠的肿瘤照片

表1 肿瘤模型小鼠肿瘤重量变化

综上可见，选取体外抗肿瘤活性显著、足量成分的海南汉黄芩素，利用小鼠肿瘤动物模型进行在体抗肿瘤作用研究，海南汉黄芩素显著抑制肿瘤体积和重量，抗肿瘤作用显著，并呈现一定的量效关系。海南汉黄芩素系具有开发价值的抗肿瘤先导化合物。

3 讨论

我们采用现代分离、分析技术对海南黄芩中的主要成分进行提取、分离，在确定活性部位的基础上，分离纯化得到具有较强活性成分的汉黄芩素，利用核磁共振等方法确定了其结构。采用肺癌、肝癌、胃癌、宫颈癌等常见肿瘤细胞，利用MTT法测定所分离化合物的细胞毒活性，结果显示海南黄芩中的汉黄芩素对HepG2、HeLa和A549细胞均显示显著的抑制活性。通过优选结构新颖活性显著的汉黄芩素进行足量制备，并对纯度进行测定，应用荷瘤动物模型评价汉黄芩素的体内抗肿瘤功效。结果表明海南汉黄芩素显著抑制肿瘤体积和重量，抗肿瘤作用显著，并呈现一定的量效关系。

综上，我们从海黄芩中发现了极具开发价值的结构新颖的高效低毒抗肿瘤先导化合物，为形成具有自主知识产权的新药奠定了科学基础。