呼吸道合胞病毒F1片段膜外区的原核表达及其多克隆抗体制备

张乐，巩新，刘波，吴军

军事医学研究院 生物工程研究所，北京 100071

呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）属副黏病毒科肺炎病毒属，为单股负链RNA病毒，是世界范围内引起婴幼儿病毒性急性下呼吸道疾病（acute lower respiratory tract illness，ALRI）最重要的病原体[1]。2岁以下的儿童中，因感染RSV而住院治疗的人数约占呼吸道疾病住院率的50%，其中2～4月龄的婴儿是住院主要人群[2]。据报道，几乎所有的儿童在2岁时都经历过RSV感染，而生命中出现反复感染是由于免疫力低下[3]。虚弱的老年人在感染RSV后死亡率大幅增加，通常表现为心脏和肺部疾病的并发症以及肌力减弱。由于严重的联合免疫缺陷症、异体骨髓移植或衰老而导致肺部CD8 T细胞功能减退的人也会因感染RSV而患上严重疾病。目前尚未有安全有效的RSV疫苗上市，世界卫生组织已将研制RSV疫苗列为全球疫苗计划的优先发展计划之一。

RSV基因组全长15 222 bp，编码11种蛋白，其中F蛋白和G蛋白是主要的保护性抗原[4]，根据G蛋白的差异可以分成A、B共2个亚型[5]。F蛋白在不同亚型间相对保守，蛋白同源性高达90%，可诱导同时抵抗A、B亚型感染的中和抗体，并且在病毒颗粒侵入宿主细胞，与细胞融合过程中起重要作用[6]，因此较多的抗体、疫苗研究都集中在F蛋白。

RSV的F蛋白是包含574个氨基酸残基的Ⅰ型糖蛋白，根据菌株的不同，F蛋白有5～6个N糖基化修饰。在合成过程中，RSV首先合成F蛋白前体（F0），为N端糖基化蛋白，没有受体结合活性，3个F0单体组装成1个三聚体，当三聚体穿过高尔基体时，单体被蛋白酶酶切，其N端和C端产物分别为F2和F1片段，通过二硫键连接[7]，主要的抗原表位多集中于F1片段，例如抗原位点Ⅱ（255～275残基）和Ⅳ（422～438残基），其中F蛋白的抗原位点Ⅱ就是美国食品药品监督管理局（FDA）批准的人源化鼠单克隆抗体——帕利珠单抗（Palivizumab）的识别表位[8]。F蛋白的研究在RSV的治疗与预防方面占有较大比重，但缺乏商业化的高效、特异性的RSV F蛋白检测抗体。因此，我们选取RSV F蛋白抗原表位较集中的F1片段膜外区作为目的片段（图1）[9]，利用原核表达系统获得目的蛋白，免疫大耳白兔，收集血清抗体，同时利用哺乳动物细胞表达RSV F蛋白膜外区作为Western印迹检测的目的抗原，检测证明血清抗体的特异性。制备的多克隆抗体为后续RSV F蛋白疫苗的研究及单克隆抗体的制备奠定了基础。

图1 呼吸道合胞病毒F蛋白结构图

1 材料与方法

1.1 材料

2 kg以上雌性大耳白兔购自北京维通利华实验动物技术有限公司；人胚肾细胞HEK293T、表达质粒pET-28a由本实验室保存；大肠杆菌Trans5α、BL21（DE3），TaqDNA聚合酶购自北京全式金生物技术有限公司；Q5热启动高保真DNA聚合酶、NdeⅠ和XhoⅠ限制性内切酶、T4DNA连接酶、彩色预染蛋白marker购自NEB公司；异丙基-β-D硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）购自北京欣经科生物技术有限公司；带有HRP的抗His标签单克隆抗体购自Abmart生物医药（上海）有限公司；RSV F蛋白全基因序列及PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；质粒小提中量试剂盒、DNA纯化回收试剂盒、化学发光检测试剂盒购自天根生物科技有限公司；弗氏完全佐剂及弗氏不完全佐剂、LipofectAMINE 3000转染试剂购自ThermoFisher公司；Goat Anti Rabbit IgG X-Adsorbed-HRP购自Sigma公司。

1.2 目的基因的获取

在NCBI网站检索获取RSV F蛋白的全长基因序列（GenBank：FJ614814.1）,委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根据文献报道，选取抗原表位较集中的F1片段膜外区（137～523残基）设计引物 RSV F1-5（5′-GGGCATATGTTCCT GGGTTTCCTATTGGGA-3′，下划线序列为NdeⅠ酶切位点）和 RSV F1-3（5′-AAACTCGAGGCCGCC GCCGCCAATCGTAGATTTGCCGGCATTGAC-3′，下划线序列为XhoⅠ酶切位点），添加His-Tag，PCR扩增RSV F1-His基因片段，琼脂糖凝胶电泳检测，用DNA回收试剂盒回收PCR片段。

1.3 大肠杆菌表达载体F1-His-pET-28a的构建

质粒pET-28a及PCR回收片段经NdeⅠ和XhoⅠ双酶切处理后进行琼脂糖凝胶电泳检测及回收，用T4DNA连接酶将RSV F1片段与线性质粒连接，并将连接产物转化大肠杆菌Trans5α感受态细胞，菌落PCR筛选阳性克隆后委托华大基因公司对其进行测序分析，测序正确的单克隆接种含卡那霉素的LB液体培养基，37℃过夜培养，用质粒提取试剂盒提取重组表达质粒，命名为pET28a-F1-His。

1.4 pET28a-F1-His在原核细胞中的表达与纯化

将pET28a-F1-His转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，挑取单克隆接种含卡那霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养过夜，按5%的接种量接种至含卡那霉素的Ⅰ号培养基中，培养至菌液D600nm值达0.6～0.8时，加入终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导表达，37℃继续培养8 h后离心收集菌体，用水重悬，超声波破碎菌体后于12 000 r/min离心10 min，分离上清和沉淀；用同样方法培养和诱导大肠杆菌BL21（DE3）作为阴性对照，通过Western印迹检测目的蛋白是否表达。

将确定表达的菌株扩大培养，超声波破菌后收集破菌沉淀，用pH9.0的Tris-HCl、8 mol/L尿素洗涤，12 000 r/min离心30 min，沉淀经pH8.5的Tris-HCl、6 mol/L胍盐溶解1 h，离心后调整上清pH值至7.5，进行镍离子亲和层析柱纯化，收集纯化洗脱液，透析至PBS缓冲液中，用12%分离胶进行SDS-PAGE分析。

1.5 抗RSV F蛋白多克隆抗体的制备

选择2 kg以上的雌性大耳白兔，将从SDSPAGE凝胶上切下的目的蛋白胶条用研钵碾磨，加入适量生理盐水重悬作为抗原，首次免疫混合等量的弗氏完全佐剂，冰浴超声波混匀后，背下皮下多点免疫；此后的加强免疫均与弗氏不完全佐剂等量混合，分别于2周后、4周后进行第2次和第3次免疫，最后一次免疫10 d后劲动脉取血，4000 r/min离心20 min分离血清，分装后保存于-80℃。

1.6 Western印迹检测多克隆抗体的特异性

用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养HEK293T细胞，接种至24孔板，每孔约2×105细胞，培养过夜，待汇合度为70%～90%时，采用LipofectAMINE 3000转染表达RSV F蛋白膜外区的质粒，6 h后更换新鲜培养基，同时培养HEK293T空细胞作为阴性对照，48 h后一同收集培养上清。将培养上清进行12%的SDS-PAGE，半干法转印到PVDF膜上，用5%的牛奶封闭液室温封闭1 h，对照组用抗His-tag（稀释度为1∶5000）抗体孵育，实验组以收集的兔血清为一抗，5%牛奶稀释（稀释度为1∶2000）孵育1 h，PBST洗涤5次，每次5 min，转到用5%牛奶以1∶5000稀释度稀释的二抗（Goat Anti Rabbit IgG X-Adsorbed-HRP）孵育1 h，PBST洗涤，用化学发光检测试剂盒检测荧光强度。

2 结果

2.1 原核表达载体pET28a-F1-His的构建及鉴定

设计引物对F1片段膜外区进行PCR扩增（图2A），纯化回收PCR产物，同时与表达载体pET-28a一同酶切，纯化回收酶切产物；用T4DNA连接酶连接目的片段与载体，构建重组质粒pET28a-F1-His（图3）；转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，菌落PCR鉴定阳性克隆（图2B）；将阳性克隆委托测序，测序结果显示插入表达载体pET28a-F1-His的F1编码序列完全正确。

图2 RSV F基因的PCR产物扩增图谱（A）及菌落PCR筛选鉴定阳性克隆（B）

图3 pET28a-F1-His表达质粒结构图

2.2 重组表达载体在原核细胞中的表达及纯化

将重组表达载体pET28a-F1-His转化宿主菌，与大肠杆菌BL21（DE3）空白菌同条件培养，IPTG诱导表达，破碎菌体并离心后进行Western印迹，全菌裂解液及离心后的沉淀中在相对分子质量约44×103处均存在蛋白条带（图4A），与理论大小一致，说明pET28a-F1-His在大肠杆菌中得到表达且以包涵体形式存在；在相对分子质量约32×103处有一条带，可能为蛋白降解条带。扩大培养阳性克隆，收集菌体，破菌、溶解后进行镍柱亲和层析纯化，SDS-PAGE分析结果显示，在相对分子质量约44×103处有与目的条带大小一致的条带（图4B），表明通过洗涤和溶解纯化的过程，获得了相对较纯的RSV F1蛋白。切胶碾磨44×103处的目的条带，进行免疫。

图4 F1蛋白膜外区在原核细胞中表达的Western印迹（A）及纯化图（B）

2.3 RSV F蛋白兔源多克隆抗体特异性检测

以3次免疫后获得的兔源血清抗体作为一抗（稀释度为1∶2000），带HRP标记的山羊抗兔抗体作为二抗进行Western印迹，检测血清中多克隆抗体的特异性，同时以抗His-tag抗体（稀释度为1∶5000）为对照，HEK293T细胞表达的RSV F蛋白的膜外区作为检测用目的蛋白。F全长蛋白在表达过程中会被酶切成F1（相对分子质量44×103）、F2（相对分子质量18×103）2个片段，Hig-Tag添加在F1 C端。结果显示，在相对分子质量约44×103处检测到目的蛋白（图5A），HEK293T空细胞中无条带，与抗His-tag抗体检测结果一致（图5B）；对应的SDS-PAGE分析显示培养上清存在较多杂蛋白，说明制备的兔源多克隆抗体能特异性检测出RSV F蛋白的表达。

图5 HEK293T细胞表达RSV F蛋白的膜外区Western印迹（A）及 SDS-PAGE（B）

3 讨论

RSV F蛋白较为保守，能够激发机体产生保护性抗体，又能诱发辅助T细胞的免疫应答，在病毒颗粒侵入宿主细胞时，促使病毒与细胞之间膜的融合，同时还会导致细胞之间发生融合，形成合胞体[10]，是RSV研究中的重要蛋白。由于缺乏特异性的RSV F蛋白检测抗体，实验研究中多采用His-tag抗体进行检测，而在疫苗的研发及制备中不能携带His-tag等外源标签，使得后续操作须去除His-tag，具有一定的局限性，因此，特异性的RSV F蛋白多克隆抗体研制极具意义。本研究利用原核细胞表达RSV F蛋白的F1片段膜外区，并制备兔源多克隆抗体，为RSV F蛋白的研究提供检测抗体，为深入探索F蛋白在RSV感染致病机理中的作用机制以及疫苗的开发奠定了基础。

RSV是引起儿童及老年人严重下呼吸道疾病的主要原因，由于感染反复多发，波及人群广，导致了较高的住院率及死亡率，造成了一定的社会经济负担[11]。目前，在RSV感染的治疗方面，采用的核酸类似物利巴韦林属于广谱抗病毒药物，大剂量长期使用可能会出现白细胞减少，引起溶血性贫血等副作用；单克隆抗体Palivizumab（Synagis）可抑制病毒进入细胞，但价格十分昂贵，限制了其广泛使用；而其多克隆抗体虽占有较大的市场份额，但由于是血源制品，来源有限且有污染的可能，存在较大风险[12]。尽管随着数十年来医学生物学的发展，RSV的疫苗研究取得了一定的进展，但目前还没有相应的疫苗上市，大部分疫苗的研究主要集中于F蛋白，部分基因载体疫苗、亚单位疫苗及减毒活疫苗已进入临床试验，能否诱发机体产生有效的保护性抗体，诱导平衡的Th1/Th2型应答是RSV疫苗研究的热点[13]。我们希望针对这些重要呼吸道病原的安全、有效的疫苗或药物可以尽早出现。