Vasorin蛋白特异单链DNA适配体的筛选与鉴定

李慧，王玮，丁红梅，董洁，黄皑雪，罗昭锋，李洁，白琛俊，李少华，邵宁生

1.军事科学院 军事医学研究院 军事认知与脑科学研究所，北京 100850；2.中国人民武装警察部队后勤学院 生物化学与分子生物学教研室，天津 300309；3.中国科学技术大学，安徽 合肥 230026

指数富集的配基系统进化（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）技术，是运用大容量的随机寡核苷酸文库，同时结合体外PCR扩增技术，以指数形式富集与靶分子特异结合的寡核苷酸适配体的高通量生物文库筛选技术[1-2]。自1990年以来，SELEX技术得到迅猛发展，已从筛选一些简单靶分子扩大到完整的细胞、病毒颗粒、细菌等复杂靶分子[3-6]。由寡核苷酸文库筛选获得的适配体具有更强的特异性和更高的亲和力，在医学基础研究、临床诊断及药物筛选等多方面得到广泛应用[7-8]。

人Vasorin（VASN）蛋白是一种典型的Ⅰ型膜蛋白，多肽链的N端在胞外，C端在胞内，含有串联的富含亮氨酸（LRR）结构域、表皮生长因子（EGF）样结构域和纤连蛋白Ⅲ（FN3）结构域，而其他含有这些结构域的细胞外基质蛋白和黏附分子通常都具有多个结合分子，通过多条通路发挥生物学功能[9]。VASN蛋白由673个氨基酸残基组成，预期相对分子量为74×103。我们通过构建VASN胞外区重组表达质粒，转化大肠杆菌，在IPTG诱导下获得了重组人VASN蛋白，经Ni2+柱纯化获得了纯度为90%的重组VASN蛋白胞外区（rhVASN）[10]。本研究以VASN蛋白作为靶分子，采用表面等离子共振（SPR）-SELEX技术筛选VASN蛋白的特异适配体，为今后开展VASN蛋白的检测和功能研究奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

人肝癌细胞株HepG2、人正常肝细胞L02均为本室保存；rhVASN融合蛋白由本课题组制备并保存[10]；VASN标准品（真核细胞表达）、VASN抗体购自Abnova公司；DMEM培养基购自Gibco BRL公司；胎牛血清为Hyclone公司产品；鲑鱼精DNA（wDNA）、酵母 tRNA（ytRNA）和牛血清白蛋白（BSA）为Sigma公司产品；TaqDNA聚合酶、dNTP和pUC18 DNA分子量标准购自天根公司；T4 PKN试剂盒购自Thermo公司；γ-32P-ATP购自PE公司；稳定链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物（stabilized streptavidin-HRP conjugate）、TMB底物显色试剂盒（luminol/enhancer solution）购自Thermo公司；SMX、HS、EDC和11-MUA购自Sigma公司；其他试剂为国产分析纯产品。

1.2 SPR-SELEX筛选流程

利用巯基法将靶蛋白固相至11-MUA芯片。在SPR（Biacore 3000）仪上用缓冲液（50 mmol/L NaOH）洗芯片至基线后取出，将靶蛋白点在芯片上于4℃过夜，SPR检测靶蛋白的结合效果，让文库（初始文库投入量为1200 pmol）与偶联到芯片上的靶蛋白孵育30～60 min，再用缓冲液（1×PBS，0.005%吐温 20）清洗 0～30 min，最后用 50 mmol/L NaOH洗脱与靶蛋白特异结合的寡核苷酸配基，通过PCR扩增制备次级文库，用于下一轮筛选。前2轮筛选用的是VASN标准品，后面用的是rhVASN。

1.3 SPR鉴定文库的富集

利用SPR仪鉴定文库是否富集，首先在SPR仪上用缓冲液（50 mmol/L NaOH）洗链霉亲和素（SA）芯片至基线，将4个通道连好SA芯片，357s处于1通道进bio-原库，1164s处于2通道进bio-第3轮库，1487s处于3、4通道进bio-第3轮库；2047s处于1、2、3通道进蛋白，2210s处于 1、3、4通道进VASN抗体，2通道进BSA抗体，收集与靶蛋白特异结合的富集文库。

1.4 富集文库的克隆、测序与分析

将第3轮文库与第3轮文库鉴定时获得的富集峰洗脱下来，PCR扩增成双链DNA（dsDNA），天然PAGE胶电泳，将目的条带切胶，经洗脱、乙醇沉淀纯化后连接到pUC18T载体，转化大肠杆菌DH5α，随机挑选40个阳性克隆进行序列测定，用MEME在线软件和RNA Structure分析软件对测序结果进行分析。

1.5 适配体的特异性、亲和力检测

1.5.1 电泳迁移率检测（EMSA） 按T4 PKN试剂盒说明书将同位素γ-32P-ATP通过置换反应使γ-32P标记适配体的5′端。取一定浓度的γ-32P标记的适配体于100℃变性5 min后立即置于冰上充分冷却 10 min，加入孵育缓冲液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2）混匀，再加入rhVASN或BSA（作为阴性对照蛋白）混匀，终体积20 μL，37℃共孵育40 min，加入5×DNA上样缓冲液，上样6%天然PAGE胶，100 V电泳120 min后卸胶，压片，磷屏成像仪扫描留图。

为进一步证实V4-2适配体与VASN蛋白的结合是特异的，在上述实验体系中分别增加3组（20、30和350倍）未加标记的V4-2与γ-32P标记的V4-2共同竞争与VASN蛋白的结合，37℃共孵育40 min终体积20 μL，上样6%天然PAGE胶，100 V电泳120 min后卸胶，压片，磷屏成像仪扫描留图。

1.5.2 ELISA分析 分别将本实验室表达纯化的rhVASN和VASN标准品分别包被到ELISA板条中，4℃过夜，次日弃包被液，每孔加入100 μL马来酸-1%蛋白封闭液，室温封闭60 min，将不同浓度的生物素标记适配体V4-2及对照序列于100℃变性5 min后立即置于冰上充分冷却10 min，加入孵育缓冲液混匀，终体积100 μL，与包被的蛋白于37℃孵育3 h，弃去孔内液体，每孔用350 μL洗涤液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2）重复洗涤 3次，每孔加入 100 μL SA-HRP 偶合物（1∶100），室温孵育40 min，弃去孔内液体，洗板5次，每孔加入100 μL TMB显色底物，37℃避光显色，当有明显颜色变化时加10 μL终止液（1 mol/L HCl），酶联仪测定D450nm值。

1.6 适配体与高表达VASN的肝癌细胞结合测定

取一定浓度的FAM标记的适配体V4-2，100℃变性5 min后立即置于冰上充分冷却10 min，加入孵育缓冲液（1×PBS，1 mmol/L MgCl2，1 μg/μL ytRNA，1 μg/μL wDNA）混 匀 ，终 体 积200 μL，再与HepG2细胞或L02细胞于37℃孵育60 min，2000 r/min 离心，弃上清，加入 350 μL 1×PBS-1 mmol/L MgCl2重悬细胞，流式细胞术检测荧光强度值，用Win MDI2.9软件分析适配体与细胞的结合情况。

2 结果

2.1 SPR-SELEX筛选

为了快速获得VASN蛋白的特异适配体，我们利用SPR仪进行筛选，随着筛选轮数的增加，逐渐延长洗涤时间，使特异结合靶蛋白的适配体尽快富集。共进行了4轮筛选，从第3轮开始出现结合峰，表明与VASN蛋白结合的适配体开始富集。与原库对照相比，第3轮次级文库出现明显的结合峰，其中SA+bio-pool3+VASN蛋白的结合值大于100，而SA+bio-原库+VASN蛋白的结合值则小于20，随后再往通道中分别加入不同抗体，结果显示SA+bio-pool3+VASN蛋白+VASN蛋白抗体组的结合值在原值基础上增加大于100，而SA+bio-pool3+VASN蛋白+BSA蛋白抗体组的结合值增加变化小于10，证实该结合是VASN特异的，而对照抗体对其结合无影响。

2.2 适配体一级结构同源性及二级结构分析

分别将第3、4轮富集文库进行克隆测序，得到40个适配体序列，通过MEME在线软件对这些序列的同源性进行比较，进一步又利用DNA Structure软件对每个家族中所包含序列的二级结构进行分析，挑选出4条序列V3-1、V3-18、V3-19和V4-2作为候选适配体，送上海生工公司化学合成，其一级序列和二级结构如图1。

2.3 适配体特异性检测

2.3.1 EMSA检测 将同位素γ-32P标记的4个候选适配体与rhVASN（或BSA，作为阴性对照）共同孵育，凝胶阻滞结果显示4个候选适配体中只有V4-2与rhVASN孵育后出现阻滞条带，并且V4-2与对照蛋白BSA共同孵育后没有阻滞条带（图2A）。竞争实验表明未带标记的V4-2可以竞争结合rhVASN，随着V4-2投入量的增大，阻滞条带逐渐减少，进一步说明V4-2与rhVASN的结合是特异的（图2B）。

2.3.2 ELISA检测 将适配体与ELISA板条中包被的VASN共同孵育，经生物素-链霉亲和素-HRP系统检测后，发现该适配体与VASN孵育后的D450nm值远高于阴性对照序列与VASN孵育后，并且V4-2不仅能特异结合本实验室表达纯化的rhVASN，还能特异结合购买的VSAN标准品（图3）。这一结果与EMSA检测结果一致。

2.4 适配体亲和力检测

ELISA检测相同包被剂量的rhVASN分别与不同剂量V4-2的结合情况，观察到VASN与V4-2的结合呈剂量依赖关系（图4）。测定不同浓度V4-2与rhVASN结合后的D450nm值，经Origin Pro 7.5软件计算得Kd值为281.3±103.7 nmol/L。

2.5 适配体与肝癌细胞结合特异性测定

据文献报道VASN在肝癌细胞株HepG2中高表达，而在LO2细胞中低表达[16]。通过流式细胞术检测FAM标记的V4-2和Gp45文库分别与肝癌细胞HepG2（或肝正常细胞L02）的结合情况，发现V4-2与L02细胞孵育后的荧光强度同原库相比几乎没有改变,结合峰不发生右移（图5A），而与HepG2细胞孵育后荧光峰值同初始文库的荧光峰值相比发生了右移（图5B）。表明V4-2能够与高表达VASN的HepG2细胞特异结合。

图1 4条候选适配体的一级序列和模拟二级结构

图2 放射性同位素检测适配体与rhVASN的结合

3 讨论

SELEX技术作为一种极其有用的分子生物学工具而越来越受到重视，并在基础医学、临床诊断和疾病治疗中都显示了广阔的应用前景。由于随机文库中的寡核苷酸序列能形成多样的空间结构，理论上来说几乎任何一个靶分子都可以利用SELEX技术筛选出与之相匹配的寡核苷酸配基，因此，SELEX技术可以筛选的靶分子范围十分广泛。经SELEX技术筛选出来的适配体具备不受免疫条件和免疫原性限制，可体外人工合成，变性与复性可逆，可修饰并有利于长期保存和室温运输等优点[11-12]。

图3 V4-2与VASN特异结合的ELISA鉴定

人VASN蛋白在果蝇中的同源蛋白又称为SLIT-like2（SLITL2），近年来多个研究认为SLIT蛋白在多种实体瘤中表达，并与肿瘤的恶性程度相关，是抑制肿瘤细胞侵袭的重要靶分子，其机制可能是通过内皮细胞表面的受体Roundabout（Robo）介导的信号通路促进新生血管形成、促进肿瘤细胞增殖、抑制肿瘤细胞凋亡、抑制白细胞迁移等[13]。研究发现，在肺癌细胞中，ADAM17通过调节VASN的水平控制TGF-β介导的上皮间叶细胞转化（EMT），临床试验也证实抑制ADAM17能够抗肿瘤[14]，可以作为靶标应用于临床，成为早期控制肿瘤发展的有效手段。目前的研究主要证明膜型表达的VASN在ADAM17的调控下剪切脱落为分泌型蛋白，分泌型蛋白通过与TGF-β结合并减弱TGF-β信号来发挥调节血管及神经突起形态发生过程[15]。VASN胞外区的LRR、EGF样和FN3结构域通常都具有多个结合分子，因此推测可能还通过多条通路发挥其他生物学功能[9]。因此，筛选能与VASN蛋白特异结合的适配体具有重要意义。

图4 V4-2与VASN的亲和力检测

图5 V4-2与肝癌细胞结合特异性测定

我们利用SPR-ELEX技术，以本实验室表达纯化的rhVASN蛋白和购买的VASN蛋白标准品做为筛选靶标进行了5轮筛选，最终筛选到能特异结合VASN蛋白而不结合其他无关蛋白的适配体V4-2。已研究证实VASN蛋白在肝癌细胞中高表达，而在肝正常细胞中低表达[16]。流式细胞术检测发现适配体V4-2与L02细胞孵育后的荧光强度同Gp45文库相比几乎没有改变，结合峰不发生右移，而当与HepG2细胞孵育后荧光峰值同Gp45文库的荧光峰值相比发生了右移。表明我们筛选得到的V4-2适配体不仅能够与表达纯化的rhVASN蛋白结合，而且能够与肿瘤细胞中天然存在的VASN蛋白结合，为深入研究VASN蛋白的功能提供了新的思路和方法。