米诺环素促进PC12细胞氧糖剥夺/复氧后神经突生长及机制研究*

杨 洋，陶 涛，付 洁，何晓英，李小刚

(西南医科大学附属医院神经内科，四川泸州 646000)

缺血性卒中是成人致残最主要的原因，大多数脑梗死患者残留严重而持久的神经功能缺损。脑梗死后神经再生和神经可塑性是当今神经科学研究的热点。目前认为受损神经元的轴突再生和突触形成与神经功能恢复密切相关，中枢神经系统损伤后神经元信息网络整合功能的重建，形成新的神经环路，可促进神经功能的恢复。米诺环素是一种第二代半合成的四环素类抗生素，被认为是目前最有前途的神经保护剂。动物研究表明，米诺环素可促进大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤后神经元轴突再生[1]，近期一项临床研究显示，急性缺血性卒中患者早期使用米诺环素可促进患者神经功能的恢复[2]。本课题组前期的体外研究表明，米诺环素对PC12细胞氧糖剥夺损伤具有保护作用，可以显著提高细胞的存活率且促进神经突的生长[3]，但其具体机制尚不明确。肌球蛋白轻链磷酸酶(myosin light chain phosphatase,MLCP)是Rho激酶(ROCK)的下游底物之一，活化的ROCK灭活MLCP，使其不能水解MLC的磷酸基团，从而提高细胞内MLC的磷酸化水平，导致生长锥的崩解及轴突回缩[4]。所以本研究旨在观察米诺环素对氧糖剥夺/复氧后PC12细胞神经突生长的影响，并探讨MLCP/MLC信号通路对神经突生长的调节作用。

1 材料与方法

1.1材料与试剂 PC12细胞高分化细胞株(中科院上海细胞库)，DMEM无糖培养基(Gibco公司)，盐酸米诺环素(美国Sigma公司)，MLCP抑制剂Calyculin A、兔抗MLC和兔抗p-MLC(美国CST公司)，兔抗MAP-2及小鼠抗GAPDH(美国Santa Cruz公司)，Dylight标记山羊抗兔抗体(碧云天生物公司)。其他试剂均购于相应代理商。

1.2PC12细胞的传代培养 体外培养PC12细胞，每3天换液1次，待细胞长满80%～90%时，用0.25%胰酶消化后，以1∶3进行传代培养，取第7～9代细胞进行实验。取生长状态良好的细胞，用DMEM培养液吹打成细胞悬液，计数后分别以5×104/孔的细胞密度接种在96孔板，4×105/孔接种在24孔板，2×106/孔接种在75 cm2的培养瓶，置于37 ℃ 5% CO2恒温孵箱内培养。

1.3氧糖剥夺/复氧模型的建立 参照本课题组前期报道的方法[5]，先去掉培养液，PBS清洗3次后，加入不含血清的DMEM无糖培养基，置于含94% N2，1% O2和5% CO2的孵箱中培养，6 h后更换成DMEM高糖培养基，置于含5% CO2的正常氧孵箱中继续培养24 h。

1.4实验分组 将PC12细胞随机分为正常组、模型组、米诺环素组(MC组)和MLCP抑制剂组(Cal组)。正常组不进行任何处理；模型组采取氧糖剥夺6 h再复氧24 h；米诺环素组在氧糖剥夺及复氧全过程中加入1 μmol/L米诺环素；MLCP抑制剂组在氧糖剥夺1 h前预先加入1 nmol/L MLCP抑制剂，余同米诺环素组。

1.5CCK-8法检测细胞活性 参照CCK-8试剂盒说明书，复氧24 h后，每组每孔均加入10 μL的CCK-8试剂，放入37 ℃孵箱中继续培养4 h，选择490 nm波长，然后在酶标仪上检测96孔板中各孔的吸光度值[OD490]，每组6个复孔，重复3次实验，按公式计算PC12细胞的存活率=[实验组平均OD490/正常组平均OD490]×100%。

1.6免疫细胞荧光 复氧24 h后，从24孔板中取出长有细胞的盖玻片，PBS洗涤3次后，室温下用4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次后滴加0.3% Triton X-100 37 ℃下破膜20 min，PBS漂洗后加10%山羊血清置于37 ℃恒温箱封闭45 min，去除血清后加入兔抗MAP2抗体(1∶100)于4 ℃恒温箱孵育过夜，对照组用PBS代替一抗，PBS漂洗后加入Dylight 594标记山羊抗兔抗体(1∶150)37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗后加入4′6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)核染5 min，50%甘油封片，荧光显微镜下观察并拍照，在200倍荧光显微镜下随机选取10个视野，实验重复3次，采用Image-Proplus软件对荧光图像进行分析，计算PC12细胞神经突的平均长度。

1.7Western blot 参照凯基全蛋白提取试剂盒说明书提取蛋白并测定样品蛋白浓度，以1∶4加入5×上样缓冲液，煮沸变性5 min。每孔加入100 μg蛋白样品进行电泳分离(12% SDS-PAGE，60 V、45 min，80 V、90 min)后转膜(PDVF膜，250 mA、40 min)，分别加入一抗MLC(1∶1 000)，p-MLC(1∶500)和GAPDH(1∶1 000)，4 ℃孵育过夜，次日加入二抗(1∶3 000)孵育后ECL显影并拍照，用Quantity One软件对条带进行分析，以目的与内参条带光密度的比值作为蛋白表达的相对含量。

2 结 果

2.1米诺环素对OGD/R损伤的PC12细胞的保护作用 复氧24 h后，模型组PC12细胞的存活率为(48.6±3.2)%，米诺环素(1 μmol/L)处理后能够明显提高氧糖剥夺/复氧后PC12细胞的存活率[(77.7±3.3)%,P<0.05,图1]，而米诺环素对正常培养PC12细胞的存活率无影响(P>0.05)。

2.2米诺环素对GAP-43蛋白表达的影响 在正常组PC12细胞中加入米诺环素后GAP-43蛋白无明显改变，米诺环素并不会促进正常PC12细胞GAP-43的表达，也对正常PC12细胞无毒性作用；MC组GAP-43蛋白的表达(1.69±0.22)较模型组明显升高(P<0.05)；而Gal组GAP-43蛋白的表达明显低于MC组(0.32±0.13vs.1.69±0.22，P<0.05)，见图2。

#：P<0.05，与正常组比较;★：P<0.05，与模型组比较

图1米诺环素对PC12细胞氧糖剥夺/复氧损伤后的保护作用

1:正常组;2:模型组;3:MC组;4:Cal组;5:正常+MC组

图2米诺环素对氧糖剥夺/复氧损伤后PC12细胞GAP-43蛋白表达的影响

2.3米诺环素促进PC12细胞氧糖剥夺/复氧损伤后神经突生长 荧光显微镜下观察可见正常组PC12细胞呈梭形，细胞两极各有一个长突起(图3)。模型组神经突平均长度为(15.75±5.92)μm，MC组为(44.79±5.36)μm，Cal组为(25.33±5.39)μm，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。

A:正常组；B:模型组；C:MC组；D:Cal组

图3米诺环素对氧糖剥夺/复氧损伤后PC12细胞神经突生长的影响(×200)

2.4米诺环素对PC12细胞OGD/R损伤后MLC磷酸化的影响 正常组PC12细胞中p-MLC蛋白仅有少量表达(0.21±0.06)；模型组p-MLC的表达显著增加(1.02±0.12)，经米诺环素处理后，PC12细胞p-MLC的表达较模型组明显下降(0.33±0.07)，差异有统计学意义(P<0.05)；预先加入抑制剂Calyculin A的PC12细胞， p-MLC的表达较MC组明显增加(1.38±0.09，P<0.05)。各组间MLC蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)，见图4。

1：正常组；2：模型组；3：MC组；4：Cal组

图4米诺环素对氧糖剥夺/复氧损伤后PC12细胞MLC磷酸化的影响

3 讨 论

缺血缺氧性脑损伤可造成不同程度的神经功能缺损，而神经功能的恢复与神经元的修复及轴突再生密切相关，促进轴突再生、神经元网络重建以及突触环路的形成是目前研究的热点，也成为神经康复的首要目标。PC12细胞氧糖剥夺/复氧损伤真实地反映了缺血性脑卒中引起的脑损害。

米诺环素是一种高脂溶性的四环素类抗生素，它具有抗菌和抗炎活性并被临床实践证实为一种治疗粉刺和关节炎的有效药物。米诺环素能有效的通过血脑屏障从而在颅脑创伤、卒中、脊髓损伤、神经退行性疾病如肌萎缩性侧索硬化、帕金森病、亨廷顿病及多发性硬化等疾病的动物模型中发挥神经保护作用[6-7]。近年来多项体外研究表明米诺环素对PC12细胞氧糖剥夺/复氧损伤具有一定的保护作用[8-9]，本研究前期的研究结果显示，100 nmol/L至10 μmol/L米诺环素能提高氧糖剥夺/复氧损伤后PC12细胞的存活率，其中1 μmol/L米诺环素对PC12细胞的保护作用最佳。因此本试验选取该浓度的米诺环素用于后续神经突生长的研究。

RhoA/ROCK信号途径是调节神经元轴突再生的主要信号通路，其下游底物之一肌球蛋白轻链(myosin light chain,MLC)是重要的细胞骨架蛋白之一，相对分子质量为20×103，其表达与突触再生密切相关。细胞内的MLC磷酸化水平对调节突出再生起到重要作用，在肌球蛋白轻链激酶(MLCK)和肌球蛋白轻链磷酸酶(MLCP)双重调节下，MLC发生磷酸化和去磷酸化的相互转化。既往研究证实，Calyculin A可通过抑制MLCP阻断神经生长因子(NGF)对PC12细胞神经突生长的促进作用[10]。生长相关蛋白-43(GAP-43)是一种表达在轴突末梢的突出前蛋白，与神经系统发育、突触形成和神经再生有着密切关系，已经被证实在神经细胞受损之后的轴突再生过程中表达明显增高，且在促进神经突生长和突出重塑中起到至关重要的作用[11-12]，可通过观察其表达水平，了解轴突再生情况。

本研究发现，氧糖剥夺/复氧可诱导PC12细胞凋亡，降低其存活率，并通过上调p-MLC，诱导神经突回缩或抑制轴突再生。复氧24 h后，MC组较模型组PC12细胞存活率明显增高，说明米诺环素可缓解PC12细胞氧糖剥夺/复氧损伤。模型组较正常组p-MLC水平明显增高，而MC组较模型组p-MLC有明显下降趋势，且细胞存活率、GAP-43的表达及轴突长度测定较模型组均有明显增高，说明米诺环素可能通过调节MLCP/MLC信号通路，调节细胞内MLC的磷酸化水平，进而缓解氧糖剥夺/复氧对PC12细胞的损伤作用并促进轴突再生。模型组较MC组p-MLC表达明显增高，GAP-43表达明显减少，且神经突长度明显缩短，说明Calyculin A可能阻断了米诺环素与MLCP/MLC信号通路的相互作用。因此，笔者认为MLCP/MLC信号通路可能与米诺环素促进PC12细胞氧糖剥夺/复氧损伤后神经轴突再生密切相关。

综上所述，本研究发现1 μmol/L米诺环素对PC12细胞氧糖剥夺/复氧损伤具有保护作用，可明显提高损伤细胞的存活率，显著促进缺血缺氧/复氧之后神经突的生长，其机制可能为米诺环素促进受损的PC12细胞中MLCP/MLC信号通路激活，使得 MLC磷酸化水平降低，同时促进GAP-43表达增加，进而促进轴突再生及突触网络的重建。本研究发现，米诺环素对氧糖剥夺/复氧损伤的PC12细胞神经突生长的促进作用与MLCP/MLC信号通路的激活密切相关，揭示了米诺环素促进PC12细胞神经突生长潜在的细胞和分子机制，为将来的临床应用提供了理论基础。未来的研究可进一步探索MLCP/MLC信号通路激活靶点，为新型药物的研究提供理论依据。