CTLA4Ig与IDO基因共转染对大鼠肝移植后免疫耐受的影响*

唐茂明，徐雪松，赖 星，吴涯昆△

(1.重庆医科大学附属第二医院肝胆外科 400010;2.重庆市万州区中西医结合医院肝胆外科 404100)

肝移植是对于终末期肝脏疾病较有效的治疗方法。尽管肝移植术后免疫排斥的发生率及程度都远低于其他实质器官，但是术后排斥反应依然是影响术后远期生存率的主要因素[1-3]。

早期研究发现细胞毒性T细胞抗原4球蛋白(CTLA4Ig)对CD28的B分子有着高亲和性，该蛋白能够在心脏、肝脏、肾脏及胰岛组织引起满意的免疫耐受[4-5]。吲哚胺2，3双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase,IDO)是一种IFN-γ诱导酶在移植术后排斥反应的进程中起着重要的作用[6]。但单独转染IDO基因未能达到有效的免疫耐受效果[7]。因此，本试验将探讨CTLA4Ig4-IDO基因共转染在大鼠肝移植术后免疫耐受中的作用。

1 材料与方法

1.1实验动物与分组 以BN大鼠[(215±35)g]分别作为供体和受体。所有大鼠均由重庆医科大学动物实验中心提供，经重庆医科大学附属第二医院实验动物伦理委员会批准。pWBP-CTLA4Ig-IDO腺病毒、pWBP-CTLAIg4腺病毒、pWBP-IDO腺病毒均由上海吉玛公司合成，选择的干扰载体为ADV15(puro/EF1α/IRES-GFP)，病毒滴度为3×108TU/mL。受体大鼠分为4组：(1)CTLA4Ig-IDO组(n=10)，在肝移植冷缺血期，夹闭肝上静脉及肝下静脉后，按1×1011/mL的浓度，向供体肝脏经门静脉转染1 mL pWBP-CTLA4Ig-IDO腺病毒(福能基因公司)；(2)CTLA4Ig组(n=10)，转染pWBP-CTLAIg4腺病毒1 mL；(3)IDO组(n=10)，转染pWBP-IDO组腺病毒1 mL；(4)对照组(n=10)，转染空载病毒1 mL。在术后14 d处死5只大鼠，提取腔静脉血液以及肝脏组织。剩余5大鼠继续喂养并用于生存率分析。全部大鼠均未出现手术操作不当、术后出血以及感染等并发症。对于未存活至14 d的大鼠，也提取其腔静脉血液及肝脏组织。

1.2肝移植模型的构建 按照改进的Kamada方法进行大鼠原位肝移植[8]。在肝移植中，将肝上静脉和门静脉以袖套法连接并将肝前静脉缝合，将支架插入共同胆管进行胆管重建，冷缺血时间小于60 min。

1.3组织病理学及免疫组织化学分析 处死受体大鼠后，将提取的供体肝脏以10%甲醛固定，石蜡包埋并以苏木素-伊红法染色。根据组织病理学结果，以Banff法对肝移植术后急性排斥反应进行分度[9]。排斥反应活性指数(rejection activity index,RAI)根据3项独立评分进行计算：静脉内皮炎症、胆管损伤以及门静脉炎症。运用二氨基联苯胺(diaminobenzidine,DAB)染色法进行免疫组织化学实验，根据其结果，检测供体肝脏组织中CTLAIg4-IDO基因的表达情况。

1.4肝移植术后肝功能评价 运用全自动生化仪(Beckman)检测大鼠静脉血血清中丙氨酸氨基转移酶(AST)、天门冬氨酸氨基转移酶(ALT)及总胆红素(TBIL)水平。

1.5RT-PCR 以TRIzol法提取肝组织mRNA后，进行RT-PCR反应，引物由福能基因公司合成。具体步骤如下：94 ℃变性60 s，58 ℃退火69 s，72 ℃延长60 s，72 ℃最终延长7 min为1个循环，共进行30个循环。利用琼脂糖凝胶电泳法分离PCR产物，同时以β-actin的相对光密度作为内参，利用溴乙锭染色、明胶成像以及图像分析系统对各细胞因子的相对表达量进行观察以及半定量计数。

1.6Western blot 利用RIPA法于冰上提取总蛋白。提取出的蛋白按照4∶1的比例加入负载缓冲液,混合后煮沸5 min,处理后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。电泳后，在4 ℃环境下，利用聚偏氟乙烯(PVDF)薄膜进行转膜,转膜后，室温下用洗膜缓冲液(TBST)清洗PVDF膜60 min。洗膜后，将PVDF膜浸泡于按1∶2 000稀释后的辣根钴氧化物酶标记的兔抗大鼠CTLA4Ig、IDO抗体溶液中，在4 ℃环境中孵育过夜。

1.7T细胞凋亡水平检测 Annexin V-FITC双标法进行T细胞凋亡检测。采用EDTA-free膜蛋白酶(Carlsbad,USA)对细胞进行消化后离心，离心后加入PBS重悬。向悬液中加入500 μL膜连蛋白V结合悬浮细胞，再加入5 μL细胞膜磷脂酰丝氨酸异硫氰酸荧光素(Annexin-FITC)，将悬液充分混合均匀。向混合均匀的悬液中加入5 μL碘化丙啶后，在室温避光条件下进行染色反应，反应时间为60 min。反应结束后，运用流式细胞术对凋亡率进行检测。

2 结 果

2.1受体生存率 所有大鼠在肝移植术后均未对饮食进行特殊限制。对照组大鼠于术后第5天起出现急性排斥反应综合征，包括：乏力、厌食、活动能力下降、进行性体质量下降及总胆红素水平持续增高等；对照组大鼠于术后第10天全部死亡。在CTLA4Ig-IDO组中，急性排斥反应出现得更晚并且程度更轻。与对照组相比，CTLA4Ig-IDO组中急性排斥反应综合征的发生率显著下降并且平均生存时间显著提高(P<0.01)。CTLA4Ig组与IDO组各项指标之间的差异没有统计学意义，但与对照组相比均存在显著差异(图1)。对照组大鼠均于10 d内死亡，而CTLA4Ig-IDO组、CTLA4Ig组以及IDO组大鼠的生存率分别为80%、20%、20%(P<0.05)，见表1。

图1 各组大鼠生存率比较

组别移植物失去功能急性肝衰竭 胆管梗阻CTLA4Ig-IDO组0 0 1IDO组 1 1 2CTLA4Ig组0 2 2对照组2 30

2.2组织病理学及免疫组织化学分析 术后14 d处死各组大鼠，提取肝脏组织进行组织病理学分析。对照组出现典型的严重急性排斥反应，例如：汇管区大量淋巴细胞、中性粒细胞、单核细胞浸润；广泛的肝小叶结构破坏；水泡样性；局部肝细胞坏死及胆管上皮损伤(图2A)。在CTLA4Ig-IDO组中，绝大部分肝脏组织表现为正常组织结构，仅存在少部分汇管区及肝小叶区淋巴细胞浸润(图2B)。CTLA4Ig-IDO组的排斥反应程度显著低于对照组。CTLA4Ig组及IDO组的排斥反应程度均较CTLA4Ig-IDO组严重，但均较对照组轻微(图2C、2D)。免疫组织化学结果显示，经门静脉灌注CTLA4Ig-IDO腺病毒后，CTLA4Ig、IDO基因的表达在CTLA4Ig-IDO组中均为阳性，而在对照组中均为阴性。

A：对照组;B:CTLA4Ig-IDO组;C:CTLA4Ig组;D:IDO组

图2各组大鼠供体肝脏组织病理学变化(HE染色，×200)

2.3血清肝功能标志物 到术后14 d为止，CTLA4Ig-IDO组中血清ALT、AST、TBIL水平均显著低于其余3组(P<0.01)。CTLA4Ig组与IDO组比较，上述各项指标差异均无统计学意义(P>0.05)，但均显著低于对照组(P<0.05)，见图3。

*：P<0.01，与其余3组比较；*：P<0.05，与对照组比较

图3各组大鼠供体肝脏肝功能血清标志物水平

2.4蛋白及mRNA表达 到术后14 d为止，对照组中IFN-γ及IL-2的mRNA水平显著高于其余3组(P<0.05)，CTLA4Ig-IDO组中IFN-γ及IL-2水平明显低于其余3组(P<0.05)。CTLA4Ig-IDO组中IL-4、IL-10、TGF-β的mRNA水平明显高于对照组中的上述细胞因子mRNA水平(P<0.05)，在CTLA4Ig组及IDO组之间，各细胞因子mRNA表达水平不存在明显差异(P>0.05)。Western blot显示各组蛋白表达水平的差异趋势与各组mRNA水平表达的差异趋势相一致。对照组中TNF-α蛋白表达水平明显高于CTLA4Ig-IDO组，见图4。

*：P<0.01，与其余3组比较；*：P<0.05，与对照组比较

图4各组大鼠供体肝脏细胞因子mRNA相对表达量

2.5T淋巴细胞凋亡水平 CTLA4Ig-IDO组外周T细胞凋亡程度(35.57%)显著高于其余3组(P<0.05)。在CTLA4Ig组(20.84%)、IDO组(22.75%)之间并不存在明显差异(P>0.05)，但与对照组(14.63%)相比，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨 论

近年来，经腺病毒基因转染减轻移植物排斥反应的方法受到了广泛关注。CTLA4Ig含有一个细胞外CTLA4结构域及IgG1结构域，对B7-1分子高度亲和，能够阻断APC与抗原特异性T细胞之间的共刺激因子信号通路[10-11]。前期研究发现，以腺病毒为载体，经门静脉转染CTLA4Ig基因能够在肝脏移植物中稳定持续表达，从而阻滞移植物中免疫活性细胞活性，诱导T淋巴细胞的凋亡、排斥反应的降低、移植术后免疫耐受的形成[4,12]。因此，笔者认为CTLA4Ig对于移植术后免疫耐受的形成有着重要作用[13-14]。

IDO参与了色氨酸代谢的调节并在APC中更加显著。有研究提出，IDO在免疫相关性应答中起着重要作用，包括移植相关免疫、肿瘤相关免疫、自身免疫性疾病及艾滋病感染等[15-16]。对于其机制，有以下2种推测:(1)局部色氨酸耗竭抑制多种细胞的生长、分化；(2)色氨酸代谢抑制外周效应T细胞并使其凋亡[17]。研究发现，色氨酸能够减轻移植后排斥反应，诱导免疫耐受的形成。ROBERT等[18]发现，CTLA4Ig引起实质器官移植后免疫耐受形成主要与IDO代谢相关。亦有研究认为，IDO对于减轻急性排斥反应、诱导免疫耐受方面无重要作用并在急性排斥反应的过程中被上调[19]。这可能是因为排斥反应程度过重或者IDO没有达到有效的活性水平。

在本实验中，笔者构建了CTLA4Ig-IDO腺病毒、CTLA4Ig腺病毒及IDO腺病毒，经门静脉转染至供体肝脏，将IDO、CTLA4Ig基因单独转染与CTLA4Ig-IDO共转染的效果进行了对比。组织病理学检查结果表明，CTLA4Ig-IDO组供体肝脏大部分表现为正常肝组织结构，仅有少部分门静脉区和肝小叶区呈现出T淋巴细胞浸润。对照组受体肝组织表现为典型急性排斥反应，CTLA4Ig组、IDO组介于两组之间。该结果表明，CTLA4Ig-IDO组对于移植术后急性排斥反应的抑制作用最为显著。

T淋巴细胞分泌的细胞因子有不同的免疫耐受调节作用，以IL-4、IL-10为代表的Th2型细胞因子能促进免疫耐受的形成，以IL-2、IFN-γ为代表的Th1型细胞因子能抑制免疫耐受的形成[20]。对照组中IFN-γ、IL-2的mRNA表达水平明显高于其余3组，CTLA4Ig-IDO组中显著低于其余3组。CTLA4Ig-IDO组中IL-4、IL-10及TGF-β的mRNA表达水平明显高于其余3组，对照组中明显低于其余3组。这表明细胞因子mRNA水平与移植后排斥反应的过程密切相关。各组T淋巴细胞凋亡指数以及受体生存率之间的差异也符合上述趋势。

综上所述，联合转染CTLA4Ig-IDO基因有着相互促进的效应，即在减少炎症细胞浸润、促进细胞因子表达向Th2型方向偏移、诱导T淋巴细胞凋亡及改善移植术后生肝功能等方面有着更显著的效果。