毛细管电泳法用于测定大鼠血浆中淫羊藿苷含量的研究

曾 雪，唐 倩，徐颖倩，刘应杰，陈 竹，夏培元

(1.重庆医药高等专科学校药学院 401331；2.陆军军医大学西南医院药剂科 400050；3.重庆市食品药品检验检测研究院 401121；4.重庆市化学药品质量控制与评价协同评价中心 401121；5.重庆市药物制剂工程技术研究中心，重庆 401331)

淫羊藿属于小檗科，具有补肝肾、强筋骨、祛风湿、抗衰老、抑制肿瘤和提高免疫力等作用。目前，国内外学者已经从淫羊藿属植物中分离鉴定出具有活性的黄酮类化合物106 种，主要是一类以羟基、甲氧基、烃氧基、异戊烯基等为取代基的 2-苯基色原酮衍生化合物。其中淫羊藿苷在人内体代谢成淫羊藿苷元，对白细胞介素(IL)-8和肿瘤坏死因子α(TNF-α) mRNA的产生有一定抑制作用，并促进机体产生促成骨细胞生长的因子，影响骨细胞的增殖，提高碱性磷酸酶的活性，从而达到治疗骨质疏松的目的[1-5]。淫羊藿成分的分析多采用高效液相色谱法(HPLC)，该方法操作步骤多，流动相处理复杂，试剂量消耗大[6-8]。高效毛细管电泳(HPCE)作为一种分离分析技术，具有高灵敏度，高分辨率，缓冲溶液处理简单，操作简便等优点，有利于开展复杂生化样品的分析，目前毛细管电泳技术配合不同的测试手段已经在天然产物化学中开展了的以黄酮化合为主的多项研究[9-11]。本文以HPCE为分析方法，以十二烷基磺酸钠(SDS)为缓冲溶液添加剂，建立检测血清中淫羊藿苷代谢物含量的方法[12-15]。

1 材料与方法

1.1实验动物 SD大鼠，雄性，体质量(200±20)g，从重庆医科大学动物实验中心购买，给药前12 h禁食，自由饮水。

1.2仪器与试剂 CL1020高效毛细管电泳仪(紫外检测器，中国北京彩陆科学仪器有限公司)，GWA-UN1型超纯水器(北京普析通用仪器有限公司)，SK-1涡旋混合器(常州国旺仪器制造有限公司)，AUX220电子天平(日本岛津)。CQ250 超 声 波 清 洗 器(上海超声波仪器厂)，TDG16台式高速离心机[屹谱仪器制造(上海)有限公司]。淫羊藿苷标准品(有效纯度98.0%,批号14110704,美仑生物科技有限公司)，磷酸(分析纯，重庆精细化工工厂)；2-丙醇(分析纯，重庆精细化工工厂)；乙腈(优级纯，天津四友化工有限公司)；十二烷基磺酸钠(SDS，相对分子质量272.38，美国)；其他实验试剂均采用分析纯。

1.3方法

1.3.1对照品溶液制备 精密称取淫羊藿对照品5 mg，置于5 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀。

1.3.2动物实验 取6只健康雄性SD大鼠，取对照品溶液灌胃给药(剂量相当于对照品0.2 mg/100 g)，灌胃后分别于0.15、0.5、1、2、3、4、5、6、8、12 h尾静脉采血0.2～0.4 mL，置于放有肝素的塑料离心管中，4 000 r/min离心10 min，取上层血浆置于-20 ℃冰箱中保存备用。再取3只健康雄性SD大鼠，同法处理收集空白血浆备用。

1.3.3血浆样品处理 取空白血浆3份约0.5 mL于5 mL塑料离心管中,直接加入对照品溶液100 μL，漩涡混合均匀，分别比较乙酸乙酯萃取-甲醇沉淀、甲醇和乙腈直接沉淀两种处理血浆的电泳图，最后确定使用乙酸乙酯萃取法-甲醇沉淀的方法处理血浆。

1.3.4样品淫羊藿苷浓度测定 采用75 μm×67.4 cm石英毛细管柱(有效长度51 cm，河北永年瑞丰色谱配件有限公司)；分离电压20 kV；进样方式采用电动进样，进样电压15 kV；进样时间5 s；操作温度25 ℃；缓冲溶液20 mmol/L磷酸，100 mmol/LSDS(20%乙腈，2% 2-丙醇)，pH2.0，检测波长254 nm。

2 结 果

2.1血浆样品处理方法考察 血浆处理方法有3种，甲醇直接沉淀法，甲醇、乙腈沉淀法，乙酸乙酯沉淀法。甲醇直接沉淀血浆，易出现乳化现象，首先排除。血浆中由于内源性干扰物较多，对比甲醇乙腈沉淀法和乙酸乙酯沉淀法，结果显示，采用乙酸乙酯萃取后，可明显减少内源性干扰物(见图1)。故本试验先采用乙酸乙酯进行萃取，然后采用甲醇沉淀处理，具体操作：取“1.3.2”项下直接加入淫羊藿苷对照品溶液的空白血浆，加入2.5 mL乙酸乙酯,振荡萃取3 min,离心(5 000 r/min,5 min),移取上清液,于37 ℃水浴氮气吹干,残渣加入100 μL甲醇漩涡振荡1 min溶解,高速离心(10 000 r/min,2 min),取上清液[11-12]。

2.2采血时间的考察 将“1.3.2”项下的大鼠灌胃给药后血样按“1.3.3”项下电泳条件进样，以成分峰响应值为指标，分析考察血药浓度达到最大的时间，作为淫羊藿苷代谢物含量测定时间(见图2)，结果显示，给药后3 h后，血药浓度达到峰值。

2.3方法学考察

2.3.1专属性试验 精密吸取实验方法“1.3.1”项下对照品溶液；实验方法“1.3.2”项下灌胃SD大鼠血浆样品和“1.3.2”项下空白血浆各0.5 mL，作为对照品溶液，供试品溶液和阴性对照溶液，按实验方法“1.3.3”项下电泳条件进行测定，记录电泳图(见图3)，结果显示阴性对照没有干扰峰，而供试品溶液的出峰时间相比对照品溶液有所后移，分析是因为淫羊藿苷在体内代谢成淫羊藿次苷Ⅱ所致。

A:甲醇+乙腈沉淀血浆；B;乙酸乙酯萃取，甲醇沉淀血浆

图1淫羊藿苷不同处理条件下的血浆HPCE

图2 6只SD大鼠体内不同时间淫羊藿苷电泳峰面积响应值

2.3.2线性关系考察 取5份空白血浆样品0.5 mL于10 mL塑料离心管中,依次加入实验方法“1.3.1”项下对照品溶液0.01、0.05、0.1、0.5、1 mL漩涡混合均匀,先乙酸乙酯萃取、然后甲醇沉淀，取上清液，得质量浓度为0.002、0.01、0.02、0.1、0.2 mg/mL梯度血浆溶液，按实验方法“1.3.3”项下条件进行电泳测定，以淫羊藿苷质量浓度为横坐标(X)，以电泳峰面积为纵坐标(Y)进行回归计算，得到回归方程为：Y=127 395X-216 893，r=0.998 7。结果表明，淫羊藿苷在0.12～2.7 mg/mL范围内线性关系良好。

2.3.3精密度试验 精密吸取实验方法“1.3.1”项下对照品溶液0.5 mL与实验方法“1.3.2”项下空白血浆中，按“结果1”项下方法处理血浆，连续进样6次，测定电泳峰面积，计算淫羊藿苷峰面积RSD=1.7%。

A:阴性对照；B:对照品溶液；C:供试品溶液

图3专属性试验

2.3.4重复性试验 另取6只健康雄性SD大鼠，取实验方法“1.3.1”项下对照品溶液灌胃给药，并于给药后3 h进行尾静脉采血，按实验方法“1.3.2”项下要求进行血样处理，按实验方法“1.3.3”项下要求进行电泳测定，计算淫羊藿苷峰面积的RSD为3.7%。

2.3.5加样回收率试验 按实验方法“1.3.2”项下方法制备6份血浆样品各0.5 mL，按实验方法“1.3.3”项下方法进行电泳测定，记录6份样品淫羊藿苷的电泳峰面积；再依次向6份样品中加入等质量淫羊藿对照品0.2 mg，按实验方法“1.3.3”项下方法进行电泳测定，记录6份样品中淫羊藿峰面积，并计算加样回收率结果(表1)。

表1 回收率试验结果(n=6)

2.4含量测定 取3只健康雄性SD大鼠，按实验方法“1.3.1”项下对照品溶液灌胃给药(剂量相当于对照品0.2 mg/100 g)，灌胃后3 h采血，并按实验方法“1.3.2”项下方法处理血浆，按实验方法“2.3.1”电泳条件测定，测得大鼠体内淫羊藿苷的含量(见表2)。

表2 大鼠体内淫羊藿苷含量

3 讨 论

本文研究目的是以HPCE为检测手段，检测血清中淫羊藿代谢物的血药浓度，为淫羊藿的体内药物分析提供新的方法和检测途径。

本文的检测对象是含药血液样本，血液中内源性干扰物多，如果直接进行电泳分析，会导致信噪比降低，目标信号被噪音掩盖，因此血液样本的前处理是关键，前处理的目的是去除内源性物质同时不会影响目标物的检测，本文比较了目前常用的3种血液处理方法，最后采用乙酸乙酯萃取血浆，甲醇沉淀的方法，避免样品乳化现象的同时，降低了内源性干扰物影响，有效提高了信噪比。

本文对大鼠采用灌胃方式给药，淫羊藿进入体内后受代谢过程影响，血药浓度呈现连续变化过程，为了准确测定淫羊藿血药浓度，本试验连续测定了给药后12 h的大鼠血药浓度，确定在灌胃给药后3 h，血药浓度达到峰值，以此时间作为采样时间，可降低检测结果的相对误差，保证结果准确度。

淫羊藿苷给药后，在大鼠体内是以代谢物形式存在，分析代谢物可能是淫羊藿次苷Ⅱ，本文并未采用淫羊藿次苷Ⅱ为对照品，而是采用淫羊藿苷为对照品，比较了淫羊藿苷对照品的电泳图、空白血清电泳图和给药后血清电泳图，证明了淫羊藿苷在体内代谢后仅仅是出峰时间出现延后，但不妨碍定量分析。

淫羊藿苷及其代谢物分子接近电中性，本文在缓冲溶液中加入SDS，调整pH到2.0，可增加待测组分带负点能力，克服缓冲溶液电渗流，利于电泳分离。但加样回收率试验RSD偏高，分析原因可能是SD大鼠个体差异、给药方式等多种因素综合导致含药量差异偏大。除此之外，进样方式存在系统误差，进样量准确度偏低，最终结果RSD偏高，后期可通过更改进样方式解决。毛细管电泳方法简便，试剂消耗量少，与高效液相色谱相比，不需要对流动相进行脱气和过滤处理，仅采用以磷酸为主的缓冲溶液即可满足分析要求。在本文中，淫羊藿苷在血浆中的含量随时间逐渐降低，本文可实现0.12 mg/mL的定量分析，具有较低定量限。同时相比于高效液相色谱，不易堵塞柱子，更适合生化样本的分析。