试剂盒法对婴幼儿配方奶粉中维生素B9的快速检测

吴胜泽，黄钟标，苏焕斌，严家俊，刘辉

（广东产品质量监督检验研究院，国家食品质量监督检验中心（广东），广东佛山528300）

0 引 言

维生素B9又称叶酸（folic acid），是一组功能和化学结构与碟酰谷氨酸（pteroylglutam ic acid，PGA）相似的化合物的统称，其广泛存在于绿叶蔬菜中，是人体必不可少的营养物质[1]。研究表明，维生素B9缺乏易引起习惯性流产、胎儿畸形、无脑儿、死胎、早产、胚胎停育等非正常妊娠的产生。同时也与新生儿白血病等癌症，以及儿童智力低下有关[2]。而摄入过量维生素B9会产出毒副作用，如神经受损、发育缓慢、降低食欲等。因此，对婴幼儿乳粉中维生素B9含量的控制极其重要。《食品安全国家标准婴儿配方食品》（GB 10765—2010）明确规定婴儿配方奶粉中维生素B9标准含量为（2.5～12.0）μg/100 k J[3]，《食品安全国家标准较大婴儿和幼儿配方食品》（GB 10767—2010）也规定较大婴儿和幼儿配方奶粉中维生素B9含量为≥1μg/100 k J[4]。

目前测定维生素B9的方法包括：比色法、高效液相色谱法、微生物法、同位素放射免疫法等。其中微生物法由于其成本低，灵敏度较高而成为许多国际机构的首选方法[5]，中国食品安全国家标准GB5413.16—2010也将生物法作为维生素B9检测的首选方法[6]。然而国家标准方法存在操作过程繁琐，准确度较低、重复性较差等缺点。而试剂盒法因其操作简单、快速灵敏等优点，能够广泛应用于婴幼儿乳品的检测。

1 实验

1.1 试剂与仪器

VitaFast®Folic Acid维生素B9试剂盒。试剂盒的组成（96孔微孔板，包被有Lactobacillus rhamnosus，无菌蒸馏水，固态维生素B9培养基，固态维生素B9标准品，贴合箔，微孔板框）。

无菌离心管（1.5 m L，50 m L），移液器，37℃恒温培养箱，95℃水浴锅，MULTISKAN M K3酶标仪，高速离心机，G&G电子天平，涡旋振荡器。

1.2 方法

1.2.1 样品前处理

精确称取1.0 g样品于50 m L离心管中，加入40 m L无菌蒸馏水，利用涡旋振荡器混匀，95℃水浴提取30 min，提取时须至少振荡5次，迅速冷却至室温，离心（8 000 r/m in，5 min），取200μL上清液于1.5 m L离心管中，稀释备用。

1.2.2 标准溶液的配制

打开固态维生素B9标准品瓶，按说明书要求加入适量无菌蒸馏水（取自试剂盒），盖上标准品瓶盖，摇匀稀释制得标准品原液。

取6个1.5m L离心管，按表1准备标准品溶液，每组做2个平行。

表1 标准曲线配制方法

1.2.3 维生素B9培养基的配制

打开固态维生素B9培养基瓶取出干燥剂，加入10 m L无菌蒸馏水（取自试剂盒），加入1 m L维生素B9缓冲液。盖上瓶盖，利用涡旋振荡器混匀，95℃水浴加热5 min，期间至少振荡2次，迅速冷却至室温，备用。

1.2.4 检测过程

按实验需求取出一定数量的微孔板固定于微孔板框中。使用移液器移取维生素B9培养基150μL/孔，移取150μL标准品或稀释的样品至指定的微孔中。

除去粘合箔上的保护层，将其平放在微孔条上，用手将粘合箔平压，使其充分封闭微孔板条。在37℃黑暗条件下孵育44～48 h。孵育结束后，再次压紧粘合箔，将微孔板翻置在桌面，在桌面平面上振荡，是微生物溶解在培养基中。撕开粘合箔，用移液管尖除去液体表面的泡沫，用酶标仪610～630 nm（或540～550 nm）条件下读取吸光度A。

1.3 定量分析方法

使用试剂盒专用的分析软件（R IDA®SOFT W in）对结果进行分析。该试剂盒标示灵敏度为0.18μg/kg，变异系数小于10%。最终检测结果应以实际测定的吸光度，并将对应的稀释倍数换算后得出。

2 结果与分析

2.1 标准曲线

以维生素B9标准品的质量分数作为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线，结果如图1所示。

图1 维生素B9标准曲线

2.2 重复性实验

取5种不同配方的奶粉进行检测，每种奶粉做5次平行实验，实验结果如表2所示。由表2可知，5种不同配方的奶粉5次平行实验的相对标准偏差（RSD%）在1.90%～4.49%之间。

表2 重复性实验结果 μg/100g

2.3 回收率实验

选取已知维生素B9质量分数的配方奶粉，取样并加入一定量的标准品溶液，进行加标回收实验，实验结果如表3所示，由表3可知，加标实验的回收率在95.60%～102.98%之间。

表3 加标回收实验结果

2.4 讨论

为避免外来微生物对实验结果的影响，实验过程应在无菌条件下进行。标准溶液。空白对照、稀释样品应进行平行实验以避免偶然因素对结果的影响。样品稀释后维生素B9浓度应在标准曲线范围内。

3 结论

本研究采用试剂盒法测定婴幼儿配方奶粉中维生素B9的含量，由重复性实验结果可知，对5种不同配方的奶粉5次平行实验的RSD%在1.90%～4.49%之间。由加标回收实验可知，加标实验的回收率在95.60%～102.98%之间，相对标准偏差（RSD%）为2.89%。说明该方法重现性好，准确度较高，适用于婴幼儿配方奶粉中维生素B9的检测。该方法与食品安全国家标准GB 5413.16—2010相比，在保证检测结果准确性的同时，具有操作步骤简单、检测周期短、消除了菌种在保存和传代过程中造成的误差等优点。该方法可以快速有效的测定婴幼儿乳品中的维生素B9含量，有利于实验室对婴幼儿乳品中维生素B9的检验与研究。