一株植物乳杆菌的粘附能力及免疫调节作用研究

2018-08-29王喆王蕊陈思涵范颖满朝新姜毓君

中国乳品工业 2018年6期

王喆，王蕊，陈思涵，范颖，满朝新，姜毓君,b

（东北农业大学a.食品学院乳品科学教育部重点实验室；b.国家乳业工程技术研究中心，哈尔滨150030）

0 引言

乳酸菌是对人体有着多种益生功能的微生物，同时也是组成先天性免疫系统重要的部分，在维持机体免疫稳态的过程中是不可缺少的[1]。乳杆菌作为重要的益生菌来源，主要是在肠黏膜上发挥其作用，所以其对肠上皮细胞的粘附能力是其发挥益生作用重要的一项标准[2-3]。益生乳杆菌通过调节肠道微生物菌群[4-5]，以及直接对固有免疫和适应性免疫系统发挥作用，以达到预防和治疗相关疾病，调节免疫功能的效果[6-7]。本研究选择了从西藏地区传统乳制品中分离得到的4株乳杆菌进行实验，对其对肠上皮细胞的粘附能力研究比较，从中选出一株有较强粘附能力的植物乳杆菌，对其在动物体内的免疫调节作用进行研究，找到其在机体免疫功能方面的证据，为后续更科学地把这株植物乳杆菌应用于开发免疫调节相关乳制品提供相关依据。

1 实验

1.1 材料

1.1.1 试验菌株、细胞及动物

干酪乳杆菌TD 085，植物乳杆菌TD 109，植物乳杆菌TD 113，嗜酸乳杆菌TD 124，分离自西藏地区传统乳制品。

人结肠癌细胞Caco-2，昆明系小白鼠。

1.1.2 培养基及主要试剂

M RS培养基：牛肉膏5.0 g，酵母粉5.0 g，胰蛋白胨10.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖20.0 g，Tw een-80 1.0 m L，硫酸锰0.25 g，柠檬酸氢二铵2.0 g，硫酸镁0.58 g，乙酸钠5.0 g，磷酸氢二钾2.0 g；蒸馏水定容至1 000m L，调节pH至5.8，121℃高压灭菌15 min，4℃保存。

DM EM细胞培养液：高糖DM EM 900 m L，胎牛血清100 m L，链霉素100μg/m L，青霉素100 U/m L，0.22μm无菌滤器过滤，4℃保存。

RPM I1640完全培养液：RPM I1640培养液过滤除菌，使用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺200 mm ol/L，青霉素100 U/m L，链霉素100 ug/L，用无菌的1 m ol/L的HC l或1 m ol/L的N aOH调pH至7.0～7.2，4℃保存。

小鼠白介素-2（IL-2）、γ-干扰素（IFN-γ）、肿瘤坏死因子（TNF-α）检测试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司。

M TT、ConA、无菌Hank's液、磷酸盐缓冲溶液（PBS），异丙醇，氢氧化钠，盐酸，氯化钠，碳酸氢钠，台盼蓝等。

1.1.3 仪器和设备

BCN 1360型生物洁净工作台，HF90型CO2培养箱，DHP-9272型电热恒温培养箱，低温冷冻离心机，高压蒸汽灭菌锅，酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 菌体对细胞的黏附作用

1.2.1.1 Caco-2细胞的培养

Caco-2细胞在含有10%的胎牛血清、100 U/m L青霉素、100μg/m L链霉素的高糖DM EM培养液中进行培养，在37℃质量分数为5%的CO2条件下培养，每2天更换一次培养液，当细胞单层生长到覆盖培养瓶表面80%左右时，用PBS洗涤细胞，0.25%胰酶消化，以1∶2的比例进行传代后，然后继续进行培养，传4代左右进行粘附实验。

1.2.1.2 乳杆菌的培养

分别将四株乳酸菌于MRS固体培养基上进行三区划线，37℃培养36～48 h后分别挑取单菌落培养于液体M RS培养基，12 h后，按2%的接种量接种于MRS液体培养基，37℃继续培养12 h，传3代后即为实验菌株。

1.2.1.3 细胞与菌体的共培养

将Caco-2细胞以每孔1×106个的浓度接种于6孔板，连续培养至极化状态（18～21 d），此时加入菌体共培养。离心后弃上清，将菌体用无菌PBS洗涤3次，转速为8 000 r/m in，4℃离心5 min，将菌体重悬于PBS即为实验所需菌体。将重悬好的菌体以108个/孔的量加入到六孔板中，每株菌做3个平行孔，在37℃质量分数为5%的CO2细胞培养箱中共培养4 h。用保存在4℃的PBS将实验组（乳杆菌作用）和对照组（无乳杆菌作用）的Caco-2细胞冲洗3次，将未粘附的菌体洗脱，随后用胰酶消化收集细胞，进行稀释涂布平板计数，计算菌体的黏附率。

1.2.2 免疫指标检测

1.2.2.1 动物分组及给药方法

本研究采用昆明系小鼠，体质量20g±2g，分为对照组（灌服生理盐水）、实验组（低剂量、中剂量和高剂量）。将植物乳杆菌TD 109制备成菌数107，108和109m L-1的菌悬液，按1m L（每100 g体质量），以表1设计方案灌服给各组小鼠，每日1次，灌胃期间自由取食，连续灌胃30 d。

1.2.2.2 脏器指数测定

在末次灌胃24 h后，称量各组小鼠体质量，然后将小鼠脱颈处死，摘取脾脏、胸腺，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，按如下公式计算脏器指数[8]，即

脏器指数=免疫器官质量（m g）/小鼠体质量（g）。

1.2.2.3 细胞因子测定

于末次灌胃后24 h摘眼球采集全血，将采集的全血放入4℃冰箱静置过夜，3 000 r/m in离心3 min，分离血清于离心管中备用。本实验采用的检测方法是双抗体夹心ABC-ELISA法，按照试剂盒说明书进行操作，绘制标注曲线，计算血清中IL-2，IFN-γ，TNF-α质量浓度。

1.2.2.4 M TT活力测定

将小鼠断颈处死后，无菌取脾脏，将脾脏200目筛网研磨后过滤，用除菌后的Hank's液洗2次，离心10 min（1 000 r/m in）。然后取1m L完全培养液将细胞悬浮于其中，用台酚兰染色，从而计数活细胞（应在95%以上），调整细胞浓度至3×106m L-1。于96孔细胞培养板中每孔加入100μL的脾细胞悬液，每个样本设10个重复孔，再加入终质量浓度为5μg/m L的ConA溶液 150μL，并用含 10%胎牛血清的RPIM 1640作空白对照。置于质量分数5%的CO 2培养箱中培养72 h，结束培养4 h前，每孔加入质量浓度为5 m g/m L的M TT 50μL，继续孵育4 h，弃掉上清液，每孔加入150μL DM SO，轻微振荡，在酶标仪570 nm读数，以空白对照孔矫正零点，结果以570 nm处的OD值表示[8]。

1.2.2.5 统计学方法

数据采用统计软件SPSS22.0处理，以均值±标准差（x±s）的形式表示，不同分组间比较采用单因素方差分析（one-way-ANOVA）的方法，P＜0.05代表差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 粘附能力测定

细胞的培养如图1和图2所示。

表1 实验分组及饲养方式

不同菌株黏附能力比较：乳杆菌主要在肠黏膜上发挥其益生功能，所以乳杆菌对肠上皮细胞的粘附能力是对其进行评价重要的一项标准，粘附能力高的菌株对免疫作用的发挥也有着促进的效果。由图3可知，不同乳杆菌对Caco-2的粘附能力存在显著差异，四株菌对细胞的粘附率分别为14.59%，18.63%，9.66%和3.71%。其中，植物乳杆菌TD 109的粘附率最高，与之前的研究[9-10]相比，具有较高的粘附率，因此选用植物乳杆菌TD 109来进行后续的研究。图3中，数据柱形标注不同字母表示差异显著（P＜0.05）。

2.2 脏器指数测定

胸腺是免疫相关的中枢器官，直接影响着外周免疫器官的发育以及细胞及体液免疫功能[11]；脾脏中有丰富的淋巴细胞，其脏器指数也可以在一定程度上反映出机体免疫能力的强弱，所以选择对小鼠的胸腺指数和脾脏指数进行测定。由表2可以看出，与对照组相比，植物乳杆菌TD 109灌胃后的各组在胸腺指数和脾脏指数上均出现了统计学差异（P＜0.05），说明低剂量、中剂量以及高剂量的植物乳杆菌都对小鼠的免疫力起到提高的作用。低、中、高剂量的胸腺指数之间比较无统计学差异（P＞0.05），低剂量组的脾脏指数与高剂量组之间具有统计学差异（P＜0.05）。

2.3 细胞因子测定

细胞因子在动物机体的免疫应答过程中起着非常重要的作用，对小鼠的研究表明，乳酸菌可以影响小鼠血液中细胞因子的含量。对患有肿瘤疾病的小鼠进行干酪乳杆菌饲喂后，其体内的IL-12和IFN-γ水平有所增加[12]，还有实验证明，乳酸菌可以通过抑制INF-α等促炎细胞因子的产生来实现对机体的免疫调节[13-14]。本实验选用了IL-2、IFN-γ、TN F-α三种细胞因子进行检测，以反映机体的免疫功能。

由表3可知，灌服植物乳杆菌TD 109提高了小鼠体内IFN-γ和IL-2的含量，且促进作用随浓度增加而增强，高剂量组与低、中剂量相比有统计学差异，但低剂量和中剂量之间无统计学差异。TN F-α的含量在乳杆菌灌胃后得到降低，但各剂量间无统计学差异。

2.4 M TT活力测定

M TT是一种测定细胞相对活力的方法，可以用来间接反映活细胞的数量。表4显示，植物乳杆菌TD 109可以增强脾细胞代谢M TT活力，与对照组比较，菌浓度为107，108和109m L-1的实验组均显现了显著性差异，且增强作用随多糖浓度的增加而增强，进一步反映出该株植物乳杆菌对机体的免疫调节作用。

表3 植物乳杆菌TD109对IL-2，IFN-γ，TNF-α的影响ng/m L

3 结论

本研究对选取的4株乳酸菌进行了黏附能力的比较，结果表明植物乳杆菌TD 109具有较强的黏附能力，可达到18.63%。在对小鼠脏器指数的测定结果中，与对照组相比较，低剂量、中剂量、高剂量组均有统计学差异，小鼠的免疫脏器发育得到了明显的促进。以上结果证明，TD 109可以通过促进小鼠胸腺及脾脏等免疫器官的发育，起到提高免疫功能的作用[15-16]。在细胞因子方面，小鼠血清中的IL-2和IFN-γ质量浓度，经过乳杆菌灌胃处理后都得到了显著的提高，肿瘤坏死因子TNF-α也出现了显著的降低，同时，通过MTT含量的测定，进一步地证明了此株菌的免疫功能。