神经干细胞提取及培养方法的体会

2018-08-29吴增董贤慧李媛靳晓飞周晓红高维娟

天津医药 2018年8期

吴增，董贤慧，李媛，靳晓飞，周晓红，高维娟△

神经干细胞（neural stem cells，NSCs）是神经系统的始祖细胞，具有自我更新与分化的能力，通过对称性分裂产生两个完全相同的NSCs，通过非对称性分裂分化为其他细胞（神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞）。NSCs作为一种特殊的干细胞，具有独特的生物学特性（分化性、迁移性、趋化性和低免疫原性），因此NSCs移植在治疗神经系统疾病中具有良好前景。开展NSCs移植的前提是获得活力和稳定性均较高的种子细胞，而NSCs较其他细胞更加脆弱，对外界环境的变化非常敏感，所以提取NSCs的技术操作应十分精细，并全面把控体外培养NSCs的影响因素。基于诸多研究者的培养经验，本课题组经过长期实践，筛选并建立了一套完善、实用、可靠的NSCs提取及体外培养方法，现报告如下。

1 主要材料和仪器

1.1 实验动物健康清洁级SD孕鼠，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2016−0011。

1.2 主要试剂和仪器主要试剂：DMEM/F−12（1∶1）、B−27、Accutase酶均购于Gibco公司；碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、表皮生长因子（EGF）均购于PeproTect公司；胎牛血清购于浙江天杭生物科技有限公司；胰蛋白酶购于北京索莱宝科技有限公司。主要仪器：3111型二氧化碳培养箱购于Thermo公司；SW−CJ−2FDSW−CJ−2FD洁净工作台购于苏州安泰空气技术有限公司；IX73型生物显微镜购于OLYMPUS公司；H2050R型离心机购于长沙湘仪离心机仪器有限公司。

2 神经干细胞的提取

2.1 提取步骤取孕14 d SD大鼠1只，麻醉后将其浸泡于75%乙醇中0.5 h（仅露出头部），然后用无菌器械取出子宫，将子宫置于75%乙醇中浸泡2 min。在洁净工作台内解剖子宫，将胎鼠置于预冷的D−Hank’s液中，迅速取出胎鼠双侧大脑皮质，置于含有D−Hank’s液的培养皿中，迅速用镊子仔细剥除脑膜，转移至含有培养基的培养皿中，眼科剪剪碎，用无菌吸管转移到离心管内，以10～12次/min的频率缓慢轻柔吹打含有脑组织的培养基（机械吹打法），吹打至无肉眼可见组织块，以1 000 r/min离心5 min，去上清，加入NSCs无血清培养基，轻柔吹打成细胞悬液，先后过200目和500目细胞筛，细胞计数后以1×106个/mL密度接种，置于37℃、5%CO2培养箱中培养，见图1。

Fig.1 A good condition of the neurospheres(×400)图1 状态良好的神经球（×400）

2.2 提取要点

2.2.1 鼠龄的选择大鼠的NSCs于胚胎第12天开始出现，第14～15天达到高峰[1−3]。

2.2.2 无菌操作原代细胞提取过程中保持无菌原则至关重要，且NSCs较其他细胞更脆弱，因此更需注意无菌操作。主要环节：保持操作环境无菌，取材室和细胞室紫外线消毒20 min；操作人员严格消毒程序，换灭菌鞋、换无菌衣、戴口罩、戴帽子、洗手、穿无菌手术衣；通过乙醇浸泡和紫外线照射两种方法对实验动物进行彻底灭菌；对所有取材器械进行高压灭菌。

2.2.3 低温与营养支持在提取过程中，应保持NSCs处于低温环境并给予营养支持。低温是活体组织和离体细胞长期保存的一种有效方法，主要通过降低细胞代谢率来起到保护作用。实验操作全程在冰板上进行，D−Hank’s液预冷，使脑组织处于低温环境中，可以最大限度提高细胞的存活率。为保证细胞的存活率，在D−Hank’s液中剥除脑膜后应立即将脑组织转移至培养基中，接种前便给予营养支持。

2.2.4 细胞分离方法原代细胞分离常采用机械吹打和胰酶消化两种方法。机械吹打法即提取步骤中所提及的方法。胰酶消化法：用无菌吸管将剪碎的大脑皮质转移到离心管内，静置2 min，去上清，加入1 mL 0.125%胰酶，消化10 min，加入培养基终止消化，以1 000 r/min离心5 min，去上清，加入培养基，轻柔吹打成细胞悬液，过细胞筛，细胞计数后接种。胰酶消化的时间很难控制，如果消化时间过长会导致消化后活细胞比例较低；胎鼠脑组织中细胞外基质和结缔组织均较少，细胞间连接不紧密，取得大脑皮质后，用眼科剪剪碎，直接轻柔吹打即可，最后将细胞悬液用细胞筛过滤，可以得到高存活率的单细胞悬液。

2.2.5 细胞过筛目的是最大限度将脑组织分离为单细胞，并去除未剥离干净的脑膜。许多研究者在实验中采用100目细胞筛（孔径150 μm）[4]、200目细胞筛（孔径75 μm）[5−6]、400目细胞筛（孔径38 μm）[7]等不同孔径的筛网。本课题组采用以上3个规格的细胞筛过滤后，在细胞培养过程中均发现培养基中有少量脑膜存在。NSCs的形态近似于圆形，直径在5～10 μm，因此课题组先后采用200目和500目细胞筛（孔径30 μm）过滤，过滤后的细胞悬液镜下观察未发现残存的脑膜，而且可以将绝大部分脑组织分离成单细胞。此外，少量脑膜的存在对于NSCs成球率和未分化状态的稳定性无影响。

3 培养基选择的依据

血清含有丰富的营养物质，对促进细胞生长有积极作用。但有研究表明含血清培养基可以诱导NSCs分化，不利于维持NSCs处于未分化状态[8]，因此课题组采用无血清培养基培养NSCs。大部分研究者采用由DMEM/F12（98%）+B27（2%）+bFGF（20 μg/L）+EGF（20 μg/L）配置而成的培养基。DMEM/F12培养基是NSCs体外培养常用的基础培养基[9]。有研究指出B27能促进原代NSCs的增殖[10]。值得注意的是，Gibco公司生产的B27有多种类型，其中不含维生素A的B27不会诱导NSCs向神经元方向分化，有利于保持NSCs处于未分化状态。bFGF可以促进NSCs的增殖[11]。EGF既可以促进NSCs的增殖，又可以促进其向神经元和神经胶质细胞分化。bFGF与EGF联合应用可以促进NSCs体外增殖，抑制其分化[12]。本课题组采用由DMEM/F12（97%）+B27（2%）+青链霉素（1%）+bFGF（20 μg/L）+EGF（20 μg/L）配置而成的NSCs无血清培养基，培养出了状态良好的神经球。需要注意的是，为保持bFGF和EGF的最大活性，每次应少量配制培养基。

4 接种密度的选择

NSCs的生长密度对于其自身的增殖有重要的影响[13]。如果细胞密度过高，细胞则会聚集成团，导致营养供应不足，活性降低，甚至会出现大量死亡的状况。如果细胞密度过低，细胞之间缺乏有效的连接，造成增殖速度减慢。因此掌握好NSCs的接种密度对于其生长十分关键。文献中提及NSCs的接种密度从 1×105～1×107个/mL不等[14−16]。课题组按照1×105、1×106和1×107个/mL 3个密度进行接种，结果显示1×106个/mL的NSCs成球速度快，神经球数量多且状态良好。

5 不同培养方法对神经干细胞的影响

目前NSCs的培养方法主要有悬浮培养法和贴壁培养法。本课题组证实采用悬浮培养法可以形成稳定的神经球，有利于保持NSCs处于未分化的状态，而采用贴壁培养法培养的细胞则非常容易分化。需要注意的是，在悬浮培养NSCs的过程中，拿、放培养瓶要尽量平稳，以免造成细胞球聚集形成较大的细胞团块。

6 不同换液方式的体会

纵观研究人员对NSCs的换液方法，有全量换液和半量换液，其中多数采用半量换液的方法。NSCs本身就是未充分发育的细胞，所以较其他细胞而言更加脆弱，对外界环境的变化更加敏感，因此维持NSCs生长环境的相对稳定十分重要，频繁换液对细胞生长不利。NSCs生长不只是吸收培养基中的营养成分，还与NSCs自身分泌的活性物质（如生长因子、黏附分子和趋化因子等）有关，NSCs通过自分泌或旁分泌的方式调节自身的生物学特性，因此不推荐使用全量换液的方法。而只加液不弃液的方法较半量换液更方便，因此推荐使用每2～3 d只加液不弃液（25 cm2培养瓶每次添加培养基1～1.5 mL）的方法。

7 传代经验总结

7.1 传代时机悬浮培养的神经球状态是判断传代时机的重要依据。据观察，活力好的神经球通常透光均匀且边缘明亮锐利。神经球的直径不宜过大，直径超过300 μm的神经球球心部较边缘厚很多，透光性减弱，球心部颜色较边缘暗。本课题组将NSCs培养至6～8 d，得到的神经球数量多、状态良好，适宜传代。

7.2 传代方法 NSCs传代方法主要有胰酶消化法、Accutase酶消化法[17]和机械吹打法等。酶消化法操作步骤：将含有NSCs的培养基转移至离心管，静置15 min，去上清，加入1 mL 0.125%的胰酶或1 mL Accutase酶，消化10 min，加入培养基终止消化，以1 500 r/min离心10 min，去上清，加入培养基，调整细胞密度为1×106个/mL，接种于培养瓶。机械吹打法操作步骤：将培养基转移至离心管，静置15 min，去上清，加入培养基，轻柔缓慢吹打10 min，调整细胞密度为1×106个/mL，接种于培养瓶。原代和1代的神经球细胞间连接不紧密，仅通过轻柔的吹打即可分离成单细胞悬液，且传代后活细胞比例最高，成球率最高，神经球可以保持稳定的未分化状态，吹打时要轻柔且避免产生气泡。2代及以后神经球通过单纯机械吹打无法使其完全分离为单细胞。采用胰酶消化法不容易掌握消化时间，对细胞损伤较大，活细胞比例相对较低，再次成球率低。损伤的细胞释放其核内DNA，这些DNA具有很强的黏性，会将分离消化的单细胞黏附在一起。本课题组对原代和1代的神经球采用机械吹打法进行传代，对2代及以后的神经球采用Accutase酶进行传代。利用Accutase酶消化2代及以后的神经球对细胞损伤最小，活细胞比例较高，成球率较高，神经球状态良好。

细胞培养过程中会出现死细胞、细胞碎片及细胞分解产物，如果不能及时清理这些物质则会影响NSCs的增殖。在传代过程中，使神经球自然沉淀，然后去除上清液，这些物质可以被最大程度地去除。原代培养的NSCs中混有一些杂细胞，经过反复传代培养后也可以被去除。

本课题组已经稳定传代培养NSCs至第7代。马浚宁等[18]发现从皮质提取的NSCs在传至9～11代后会出现神经球贴壁的现象，海马和嗅球区的NSCs也有类似现象，提示NSCs的悬浮特性会随着传代次数的增加而减弱。

8 神经干细胞标志物的选择

目前已经发现的NSCs标志物有巢蛋白、Musashi、神经元特异性烯醇化酶、波形蛋白1、细胞黏附分子等。大部分研究者把巢蛋白作为鉴定NSCs的标志物，巢蛋白又称为nestin，属于Ⅵ型中间丝蛋白，其表达具有时序性，nestin在分裂增殖能力旺盛的NSCs中高表达，在NSCs向终末细胞（神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞）分化过程中逐渐减弱，已经广泛应用于体外培养的NSCs的鉴定[19]。