苍术酮对急性肺损伤小鼠保护作用的研究

陈天阳，刘廷亮，侯天禄，平 键，胡毅翔，成 扬，陈建杰

(1.上海市浦东新区传染病医院，上海 201299；2.上海中医药大学附属曙光医院，上海 201203；3.上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心，上海 200127；4.浙江省医学科学院/浙江省实验动物与安全性研究重点实验室，浙江 杭州 310013)

急性肺损伤是一种由直接因素或间接因素导致的急性缺氧性呼吸功能不全，其重症表现为急性呼吸窘迫综合征[1]，并且病死率较高。目前尚无治疗急性肺损伤的特效药物和手段，临床主要以支持治疗为主，因此，探索寻找新的药物来治疗急性肺损伤是非常紧要的。从传统中草药中寻找新的有效成分，或者在已知的有效成分中探索寻找新的药理作用是一个重要方向[2]。苍术用于治疗呼吸道疾病已经数千年[3],其所含化学成分较复杂，药理活性较广泛，但苍术提取物及其活性成分对急性肺损伤的作用和机制尚不明确。本研究观察了苍术提取物苍术酮对急性肺损伤小鼠肺组织病理、肺指数以及生存率的影响，旨在为其临床应用提供理论依据。

1 实验资料

1.1动物 雄性SPF级ICR小鼠，体质量(22±2)g，由浙江省实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK(浙)2014-0001。

1.2药物 中药苍术购自华东药业公司(上海)，由浙江中医药大学鉴定，标本(编号：y20141022)存放在浙江医学院药学系。

1.3苍术酮的提取与分离 采用HA121的超临界液体萃取仪(华安仪器厂，江苏，中国)进行超临界二氧化碳萃取。取苍术饮片100 g粉碎成粉末，置于萃取釜内，在350 bar压力、50 ℃条件先动态提取60 min，乙醇(99.9%)作为改性剂，流速为5 mL/min。超临界二氧化碳流速设定为15 g/min，静态萃取时间设定为30 min。去除溶剂，得到的产物浓度为5.8%。用于体外研究的超临界二氧化碳萃取物溶于磷酸盐缓冲液，浓度为1 mg/mL。将超临界二氧化碳萃取物(50 g)用于硅胶柱，使用石油醚(沸点60～90 ℃)和乙酸乙酯(30∶1→1∶1，V/V)进行分离。首先制备色谱柱：称取硅胶40 g，将硅胶与洗脱剂按比例混合(20∶1)，搅拌除去空气泡，徐徐倾入色谱柱中，不能留有气泡，然后加入石油醚将附着在管壁的硅胶洗下，使色谱柱面平整，平衡1 h后加入供试品进行洗脱。将萃取物溶于石油醚中，沿着色谱柱管壁缓慢加入，当液面下降至与柱表面相平时，即从色谱柱顶端沿管壁缓慢加入洗脱剂石油醚，打开底阀，控制流速为1 mL/min，当流过色谱柱的一个空体积后即用标号的试剂瓶开始收集。得到化合物4(6 mg)、化合物3(2 mg)、化合物5(50 mg)、化合物6(4 mg)、化合物1(10 mg)和化合物2(13 mg)。采用紫外光谱、质谱分析、1H和13C核磁共振光谱鉴定，上述化合物分别为α-姜黄烯(6 mg)、苍术醇(2 mg)、苍术酮(50 mg)、苍术呋喃烃(4 mg)、苍术内酯I(10 mg)、苍术内酯Ⅲ(13 mg)。将苍术酮低温(-18 ℃)避光保存，备用。

1.4试剂与仪器 甲型流感A/PR/8/34病毒(H1N1亚型)和A/深圳/203/2001(H3N2亚型)由浙江省疾病预防控制中心保存；利巴韦林，上海现代哈森(商丘)药业有限公司；HA121超临界液体萃取仪，江苏华安仪器厂产品。

1.5实验方法

1.5.1实验一 取144只雄性SPF级ICR小鼠，体质量(22±2)g，随机选择24只作为正常组，其余小鼠在乙醚麻醉下通过鼻内接种甲型流感病毒诱导感染制作病毒性肺炎模型，然后随机分为模型组、利巴韦林组、苍术酮高剂量组、苍术酮中剂量组和苍术酮低剂量组，每组24只。造模2 h后，苍术酮高、中、低剂量组分别给予40 mg/kg、20 mg/kg、10 mg/kg苍术酮灌胃，利巴韦林组给予50 mg/kg利巴韦林灌胃，正常组和模型组给予等量生理盐水灌胃，均每日1次，共5 d。实验结束后每组随机取10只小鼠处死，切除全肺并称质量，计算肺指数和肺指数抑制率。肺指数=小鼠肺质量/小鼠体质量，肺指数抑制率=(模型组肺指数-干预组肺指数)/模型组肺指数×100%。然后将肺组织固定在10%中性福尔马林缓冲溶液中固定处理，石蜡包埋，切成4 μm切片，根据标准流程进行脱蜡和水化，切片进行HE染色，镜下观察肺组织病理变化。

1.5.2实验二 另取120只雄性SPF级ICR小鼠，体质量(22±2)g。造模、分组及干预同实验一，每组20只。灌胃5 d后继续观察，统计第15天各组小鼠的存活情况，并计算存活时间。

2 结 果

2.1各组小鼠肺指数和肺指数抑制率比较 模型组肺指数明显高于正常组(P<0.05)，利巴韦林组和苍术酮各组肺指数均明显低于模型组(P均<0.05),且利巴韦林组和苍术酮高剂量组明显低于苍术酮低剂量组(P均<0.05)；利巴韦林组和苍术酮高剂量组肺指数抑制率明显高于苍术酮低剂量组(P均<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠肺指数和肺指数抑制率比较

注：①与模型组比较，P<0.05；②与苍术酮低剂量组比较，P<0.05。

2.2各组小鼠肺组织病理学表现 HE染色显示，与模型组比较，各给药组肺组织肺泡明显，细胞相对较完整，炎性渗出减少，肺细胞间隔增厚较轻，细支气管上皮柱状细胞脱落减少。各组染色表现见图1～6。

2.3各组小鼠生存情况 正常均存活；模型组存活3只(15%)，存活时间(7.9±2.8)d；利巴韦林组存活10只(50%)，存活时间(11.1±3.1)d；苍术酮低剂量组存活6只(30%)，存活时间(9.3±3.6)d；苍术酮中剂量组存活11只(55%)，存活时间(11.2±3.3)d；苍术酮高剂量组存活14只(70%)，存活时间(12.4±2.6)d。利巴韦林组和苍术酮各组小鼠生存率明显高于模型组，存活时间显著长于模型组，且苍术酮高剂量组生存率明显高于苍术酮低剂量组，存活时间显著长于苍术酮低剂量组，差异均有统计学意义(P均<0.05)。

图1 正常组小鼠肺组织HE染色表现(×200)

图2 模型组小鼠肺组织HE染色表现(×200)

图3 利巴韦林组小鼠肺组织HE染色表现(×200)

图4 苍术酮低剂量组小鼠肺组织HE染色表现(×200)

图5 苍术酮中剂量组小鼠肺组织HE染色表现(×200)

图6 苍术酮高剂量组小鼠肺组织HE染色表现(×200)

3 讨 论

甲型流感病毒感染后，会引起红细胞凝集和单核细胞浸润，造成肺部大量炎性细胞浸润而损伤正常细胞的结构和功能，从而引起病毒性肺炎，表现为支气管上皮细胞脱落，管壁血管扩张充血、炎性细胞浸润，肺泡壁毛细血管扩张充血、大量单核细胞浸润[4]。目前，甲型流感病毒造成的急性肺损伤病死率很高，但是尚无可行、有效的治疗方法[5-6]。

苍术为菊科植物茅苍术Atractylodeslancea(Thunb.)DC.或北苍术Atractylodeschinensis(DC.)Koidz.的干燥根茎[7]，味辛、苦，性温，具有燥湿健脾、祛风散寒的功效，其作为许多中药方剂的组成部分，自古以来广泛应用于临床。现代药理作用显示苍术具有抗炎、降血糖、抗缺氧、抗菌、抗病毒、保肝等作用[8]。苍术属植物的化学成分主要有挥发油、苷、糖、黄酮及甾醇、营养物质等，挥发油由一系列倍半萜和聚乙烯炔类及少量酚类和倍半萜内酯等组成，倍半萜主要成分为β-桉叶醇(β-Eudesmol)、茅术醇(Hinesol)和苍术酮(Atractylon)等[9]，其中苍术酮具有抗流感病毒的作用[10]。为此本实验观察了苍术酮对甲型流感病毒诱导的肺损伤保护作用，探讨其用于临床甲型流感病毒感染治疗的价值。

本实验观察到，模型组肺指数明显高于正常组，利巴韦林组和苍术酮各组肺指数均明显低于模型组,且利巴韦林组和苍术酮高剂量组明显低于苍术酮低剂量组；各给药组肺组织肺泡明显，细胞相对较完整，炎性渗出减少，肺细胞间隔增厚较轻，细支气管上皮柱状细胞脱落减少；利巴韦林组和苍术酮各组小鼠存活时间显著长于模型组，生存率明显高于模型组，且苍术酮高剂量组存活时间显著长于苍术酮低剂量组，生存率明显高于苍术酮低剂量组。提示苍术酮对甲型流感病毒所诱导的急性肺损伤具有保护作用，能够明显减轻肺部炎症，可延长小鼠存活时间，提高生存率，且呈剂量依赖性，为其临床应用提供了一定实验依据，但其具体作用机制仍需进一步研究。