获前应用有益真菌阻止获后真菌毒素的污染

叶 萱 编译

(上海市农药研究所，上海 200032)

1 有益真菌和生物防治策略

欧盟委员会为了减少农药使用风险和降低农药的使用对人类健康和环境的影响，出台了有关农药持续使用的欧盟指令2009/128/EC。此指令重要特征之一就是每个成员国应该开发和采用国家行动计划，建立定量目标、措施和时间表来降低农药使用对人类健康和环境的风险和影响，鼓励开发和引入综合害物管理或替代性方法或技术，降低对农药使用的依赖。农业工业也释放出强烈的信号，许多公司以前注重开发、登记和商业化化学农药，现在收购已在开发或有潜力开发有益微生物的新生物农药的小公司。

1.1 有益真菌

有益真菌(包括丝状真菌和酵母)是一大类“好”生物，能够干扰植物病原菌的生长，对植物有积极的影响，具有潜在生物活性，可开发为生物农药。数个真菌品种以寄生、竞争、抗菌或诱导产生抗性等机制与植物病原菌相互作用。寄生是一个真菌直接攻击另一真菌，是一个非常复杂的过程，主要包括3部分：识别、攻击和随后的渗透，最后杀死寄主。2个或更多生物需要相同的资源时，而只有一个生物使用此资源，它们之间就会进行竞争。除了营养，它们也会为空间或侵染点发生竞争，众所周知在病原菌和有益生物间的竞争是生物防治的重要问题。抗菌是指生产和释放对其他微生物有毒或杀死其他微生物的分子，能有效防治植物病原菌。真菌能产生多种多样有毒物质，有助于其定殖和占有基质。最后有益真菌定殖于植物，刺激寄主产生防御反应，提高对植物病原菌的抗性。

全球有数个商业化微生物农药，可用于生物作物保护项目和综合害物管理策略，后者可合用剂量减少的化学农药。对化学杀菌剂的耐受性是有益菌株实际应用的一大优势。耐受性生物和杀菌剂合并使用，杀菌剂能够限制天然生活于基质中的真菌种群的竞争，使有益生物发挥最大效力。如果有益真菌和与其相兼容的杀菌剂作用于同一靶标，有益真菌和杀菌剂合用可能具有相加效应，进行种子处理时，早期化学杀菌剂有很好的保护性，苗期有益真菌有高的保护作用，是种子处理的制胜策略。

木霉菌是研究最多的有益真菌之一，是商业化生物农药主要使用的活性成分之一。这些真菌对许多化学农药有耐受性，适宜用于综合害物管理。

木霉菌主要存在于土壤中，除了木霉菌，研究人员正在调查未开发的生态小生境来发现新的品种和属，或确定对植物病原菌有防治作用的新颖菌株。“新颖”有益真菌——印度梨形孢(Piriformospora indica)促进扦插不定根的形成，增加对干旱的耐性，诱导赤霉素的产生，赤霉素能调节植物根的防御性。

1.2 对产生真菌毒素的植物病原菌的防治

防治产生真菌毒素的植物病原菌真菌很重要，因为它们被认为是对食品安全威胁最大的真菌。真菌毒素是低分子量的有毒化合物，是真菌产生的次级代谢产物，天然存在于全球约25%的粮食和饲料作物中。已知全球至少有300～400种真菌毒素具有生物活性，最常见的有黄曲霉毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、烟曲霉毒素和赭曲霉毒素A。这些化合物主要由曲霉属、青霉属或镰刀霉属菌产生。作物收获前在田间可能会发生真菌毒素的污染，这主要取决于环境条件，在收获后，由于贮存不当也会发生污染。

已开发了许多用于获前和获后的化学、物理和生物方法来防治产生真菌毒素的病原菌，防治真菌毒素污染风险的发生，或对粮食和饲料中积累的真菌毒素进行去污染或解毒。

本文主要介绍了在获前谷物田和果树园应用有益真菌，阻止获后的真菌毒素的污染。表2列出了文中介绍的一些生物和其有益作用。

2 阻止谷物中真菌毒素的产生

主粮为全球人口饮食的主要组成部分，满足一大部分热量和营养需要。在全球5万多植物品种中，15个作物提供的能量为全球人口摄入的90%，其中3种：水稻、玉米和小麦提供的热量为这90%的2/3。这些谷物为40多亿人口的主粮。在西欧，谷物占主粮的26%(根据能量估算)，在非洲，谷物为46%。

谷物为产生真菌毒素真菌侵染的常见靶标，这些真菌可引起田间数种作物产量损失，产生的真菌毒素在收获的作物中积累导致其品质下降。然而在收获后，在颖果和不正确贮存条件下真菌生长，继续产生真菌毒素。笔者介绍了在栽培期间如何应用有益真菌以减少粮食和饲料商品中的真菌毒素积累的例子，主要为小麦上的赤霉菌造成单端孢霉烯污染，曲霉菌侵染玉米，产生黄曲霉毒素污染玉米。

表1 以木霉属菌为生物活性成分的商业生物农药

2.1 小麦上的赤霉菌

小麦为全球人口提供了所需的 20%卡路里，也是动物饲料的重要来源。全球人口的增长，对小麦的需求也在增加，小麦的生产对食品安全和全球经济有重要影响。世界银行估计全球小麦生产在2000～2050年将需要增加60%。全球农民将需要利用有限的资源，如肥料、农药和水来增加小麦的生产。

赤霉病是全球小麦和其他小谷物的再发性病害，由数种真菌品种引起，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)和黄色镰孢菌(Fusarium culmorum)是主要的致病菌。镰刀菌属菌侵染小麦穗后，常常产生单端孢霉烯，特别是脱氧雪腐镰刀菌烯醇和其乙酰化衍生物3-和15-乙酰化脱氧雪腐镰刀菌烯醇，使小麦产量和品质都发生改变。

早期检测和防治产生单端孢霉烯的镰刀菌属菌对阻止毒素进入食物链重要。有多种策略可降低赤霉病的影响，包括使用健康种子、作物轮作、耕作措施、耐受性栽培品种和应用杀菌剂。然而，其中单独一种策略无法降低病害的影响，包括贮存期间产毒真菌的进一步发展。常用叶面杀菌剂防治真菌病害，如赤霉病，但非靶标真菌也可能受到影响。杀菌剂对非靶标生物的影响，如叶面真菌，可能压制植物病原菌的竞争者腐生营养菌。

在病害发展周期中，农作物残留物和开花期穗状花序为重要问题。病原菌利用栽培残留物进行越冬，而开花期是小麦对病原菌最敏感的生长阶段。生物防治赤霉病需要用有益真菌处理作物残留物以减少植物残留物中的病原菌生物量，或处理开花期的穗状花序，阻止病原菌侵染植物。两种情况下，竞争营养和空间对有益菌株防治赤霉病菌重要。除了好的定殖竞争能力外，即先于病原菌定殖于土壤中的麦秆或取代栽培残留物中的镰刀菌属菌，或定殖于穗状花序，避免病原菌入侵花，重寄生和/或抗菌机制可能也有助于防治病原菌。有益真菌直接攻击病原菌菌丝体以及抑制其生长可能减少接种体的存在量。

表2 获前应用有益丝状真菌和酵母防治获后病原菌和阻止真菌毒素的积累

虽然应用有益真菌是潜在的防治赤霉病的好策略，但相关信息几乎没有。在实验室和田间试验中已研究了Trichoderma gamsii T6085，发现其作为拮抗剂，是天然基质的重寄生菌和竞争者，能降低禾谷镰刀菌和黄色镰孢菌的生长。T. gamsii处理水稻后21 d，病原菌产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇的能力也显著下降(禾谷镰刀菌和黄色镰孢菌分别从 151.04和22.05下降到4.99和1.75 mg/kg)，因此，潜在地降低了贮存期间此真菌毒素积累的风险。此菌株在脱氧雪腐镰刀菌烯醇存在时也能够生长，这对于木霉菌属是罕见的特征。此外，在田间把 Trichoderma gamsii T6085用于穗状花序，能显著降低病害的严重性(10%)。

粉红粘帚霉(Clonostachys rosea)是另一被广泛研究的防治赤霉病的生物防治剂的重要和有发展前景的有益真菌。粉红粘帚霉菌株IK726是能够防治产真菌毒素的镰刀菌属(包括禾谷镰刀菌和黄色镰孢菌)的重寄生菌株，能限制玉米烯酮和脱氧雪腐镰刀菌烯醇的积累和降解玉米赤霉烯酮。在实验室分析了粉红粘帚霉降低小麦麦秆中禾谷镰刀菌和黄色镰孢菌孢子形成的能力，发现一些菌株有效。把其中1个菌株用于田间试验，发现对禾谷镰刀菌有生物控制活性，可导致病原菌的DNA减少68.3%。

在田间条件下粉红粘帚霉ACM941菌株能够降低不同作物残留物上玉蜀黍赤霉菌(Gibberella zeae)子囊壳的产生(玉米、大豆和小麦残留物中分别为93.1%、94.4%和84.0%)，降低小麦赤霉病的发病程度。因此，此菌株是有发展前景的生物防治剂，可有效用于赤霉病综合管理项目。

粉红粘帚霉菌株也对植物生产中使用的许多农药不敏感或敏感性低，与减量的化学农药合用能够有效防治小麦镰刀菌根腐病。已广泛研究了粉红粘帚霉对杀菌剂耐受性的机制，正在计划田间合用此菌株与杀菌剂防治赤霉病。

除 Trichoderma gamsii和粉红粘帚霉等丝状真菌外，酵母菌也是有发展前景的生物防治剂，在收获前使用防治赤霉病以及防止获后真菌毒素的积累。Wachowska和Glowacka研究了温室中生物防治剂出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans)对冬小麦上赤霉病发展和镰刀菌对谷粒污染的影响。出芽短梗霉菌使赤霉病发生程度减轻约20%，谷粒饱满度增加5.0%，谷粒增加。

生物防治剂混用有时比单剂能更大程度降低植物病害，如1个浅黄隐球酵母(Cryptococcus flavescens)菌株和2个金黄色隐球酵母(Cryptococcus aureus)，它们是2个和3个菌株一起培养来评估不同混用对赤霉菌的作用。在温室，一起培养浅黄隐球酵母和一个金黄色因秋菊奥姆菌株能显著降低病害的发生程度(32.0%)。另一方面，在小麦田间试验中，这两个菌株一起培养病原菌生物量下降了。此方法看来很有前景，可深入研究。最后，在温室中，把早熟禾镰刀菌与链格孢属、附球菌属和木霉属一起接种于小麦上，可降低赤霉病发病程度，但没有减少 T-2毒素的积累。

2.2 玉米上的链格孢属菌

全球玉米产量约为7.9亿t，在一些国家，玉米提供的热量和蛋白质为人们摄入的 1/3以上。黄曲霉毒素的存在，链格孢菌产生的致癌真菌毒素是影响此作物的广泛风险。在田间，玉米花频繁受到黄曲霉(A. flavus)、寄生曲霉(A. parasiticus)和集峰曲霉(Aspergillus nomius)等链格孢菌侵染，特别是在发展中国家，在收获后的贮存期间，这些病菌进一步发展，作物被黄曲霉毒素污染。

100多个国家已加强或提议管理粮食和饲料中黄曲霉毒素水平。为了预防区域和国际市场对产品的拒绝，持续管理产黄曲霉毒素曲霉属菌有助于阻止黄曲霉毒素相关的健康风险发生。作物抗性育种和转基因工程，农艺技术措施的调整和生物防治是控制和管理黄曲霉毒素污染的主要策略。生物防治被认为是管理玉米污染的最有发展前景和有效的生态友好型方法。

在贮存期间，许多种害虫危害谷物。昆虫活动所产生的湿度是产真菌毒素真菌生存的理想条件，贮存玉米中昆虫的数量应保持最少。已研究了昆虫病原真菌淡紫紫孢菌(Purpureocillium lilacinum)单用和与抗氧化剂 BHT[2,6-二(叔丁基)-对甲苯酚]合用防治传播产黄曲霉毒素真菌的昆虫介质杂拟谷盗(Tribolium confusum)的效果，发现二者合用能最有效地降低昆虫介质的量和黄曲霉毒素 AFB的水平(真菌毒素减少99.3%，aw为0.97)。因此，这是综合管理贮存玉米害虫有发展前景的策略，也能降解真菌毒素污染的风险。

生物防治剂的使用要求要很好地掌握病原菌生命周期知识，已发现竞争是成功管理黄曲霉素对玉米污染的作用机制。链格孢菌属黄曲霉有产黄曲霉毒素和不产生毒素的菌株。阻止黄曲霉毒素污染获前敏感作物的生物防治策略为引入不产黄曲霉毒素的黄曲霉菌株与产黄曲霉毒素的曲霉菌竞争。此策略在防止玉米等数种作物不被黄曲霉毒素污染方面很有发展前景。

在全球的不同地方已数次成功应用单一不产毒菌株。2个菌株是2个制剂——AF-36 (Arizona 棉花研究和保护委员会，美国)和Afla-Guar (先正达作物保护公司，美国)的活性成分。这些生物产品已在美国商业化用于玉米，然而，许多其他不产毒素的菌株也在评估中。实际上，在意大利也在对相似的产品进行评估中，以持续降低黄曲霉毒素污染玉米的风险。

黄曲霉毒素极大阻碍了非洲人民健康和幸福水平的提高，他们长期暴露于不安全水平的黄曲霉毒素中。农民家庭在生产、贮存、制备和市场化消费的食物过程中，没有真菌毒素污染风险意识。例如，在2015年在肯尼亚，至少230万袋玉米含有较高水平的真菌毒素，不适宜消费和贸易，给成千上万小农户带来巨大的经济损失。同年，Okun和其合作者调查了肯尼亚种植玉米的土壤中真菌的种群，确定产黄曲霉毒素链格孢菌的分布和地方性不产毒素的菌株。在7个农业生态区收集到属于黄曲霉和寄生曲霉的220菌株。用形态和生理学对它们进行了表征，以评估它们防治肯尼亚最重要的产毒素菌株的应用潜力。

北非热带国际农业研究所、美国农业部农业研究服务中心、波恩大学和伊巴丹大学间合作开发了Aflasafe产品，其是尼日利亚的4个不产毒素黄曲霉菌株的混合物。这些菌株能够与产毒菌株竞争定殖于土壤中的有机物质和植物残留物上。它们不会影响环境中的链格孢菌的总量，但促进这些真菌从产毒种群转换为非产毒种群。

多个菌株的使用被认为是对生态友好的方法。报道多个不产毒素的黄曲霉菌株具有好的协同作用，能够较大地降低田间黄曲霉毒素的污染。在2014年，Atehnkeng等人评估了以不同VCGs类别的4个不产毒黄曲霉菌株为活性成分的产品的活性，结果为其能67%～95.0%降低玉米被黄曲霉毒素污染的程度。

从生态的角度看，用不产毒素的黄曲霉有效防治产毒素的黄曲霉需要不产毒素黄曲霉菌能很好适应和生存于靶标农业生态系统中。在2014年，Ehrlich发表了一篇关于用不产生毒素的曲霉属防治黄曲霉毒素污染综述。Ehrlich介绍到这是当前降低获前玉米被黄曲霉毒素污染最有发展前景的生物防治策略之一，但也分析了存在的诸多问题：⑴ 此方法的长期效力和引入的菌株在环境中的归属；⑵ 黄曲霉种群生物学特性未知；⑶ 气候的改变对植物、病原菌和引入的不产生黄曲霉毒素的菌株的影响。

不产生黄曲霉毒素菌株干扰产毒素菌株的黄曲霉毒素累计的机制还不完全清楚。不产毒素菌株的有益影响被解释为竞争排斥机制，即妨碍产生毒素菌株的生长或到达种子。最近 Damann的一篇综述提出了此类生物防治活性的主要机制——“接触抑制”作用。接触抑制被定义为种内黄曲霉毒素抑制，是指在侵染过程中竞争菌株生长，菌丝物理相互作用或接触，触发阻碍黄曲霉毒素产生的反应。

Persons等人研究发现酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)能有效抑制黄曲霉和寄生曲霉的生长，可以菌落形成单位(CFU)表示，在22 ℃作用最大。此研究开启了用此酵母保护用于人类和动物食物的农产品免受这些病原菌释放毒素代谢物的污染。

3 防止真菌毒素污染水果

3.1 葡萄上的曲霉属菌

根据国际葡萄和葡萄酒组织，在2014年全球葡萄产量为7 510万t，中国为第一大生产过国，生产1150万t，随后为意大利和美国，都约为700万t。中国跻身为葡萄生产大国时间不久。在2015年，中国只排位第五，前4国为意大利、美国、法国和西班牙。一些葡萄用于酿酒，但全球许多的葡萄被制成果汁或葡萄干。

葡萄栽培中重要的安全环节为赭曲霉素A，它对肾有害，可致肾癌、致畸，抑制免疫反应。此真菌毒素在全球被认为是葡萄、葡萄酒、果酒以及葡萄果汁等其他葡萄产品的主要污染物。黑曲霉属在葡萄园非常常见，而Aspergilli niger和Aspergilli carbonarius是最主要的病菌。它们被认为是葡萄中赭曲霉素 A和收获后其衍生物的主要产生者，而 Aspergilli carbonarius被认为是赭曲霉素A的最主要产生者。

数个收获前策略致力于降低真菌侵染的风险和中间和最终产品的毒素污染。尽管采用预防性策略，如保护葡萄不受机械和昆虫损害以阻止产生赭曲霉素菌株定殖于受损的植物部分，或进行化学防治，但使用生物制剂是确保减少化学物质对环境和人类健康影响的最生态友好的方法。酵母被认为是用于防止赭曲霉素A污染葡萄风险的生物防治策略的最适宜生物。它们对营养需求简单，能在不同环境条件下生存，生长速度快，不产生有毒化合物，特别适宜作为有益生物。酵母能够定殖于水果表面，与植物病原菌竞争营养的能力强。另外，病原菌获得的营养物质少，其次级代谢物质如真菌毒素产生减少。

附生酵母是葡萄果实表面微生物群落的最大部分，它们已适应了此生态生境，在获前应用，能成功防治产生毒素的曲霉属菌。季蒙假丝酵母(Candida guilliermondii)vs曲霉属，东方伊萨酵母(Issatchenkia orientalis) vs Aspergilli carbonarius和Aspergilli niger，美极梅奇酵母(Metschnikowia pulcherrima)、陆生伊萨酵母(Issatchenkia terricola)和Candida incommunis vs Aspergilli carbonarius和Aspergilli niger，出芽短梗霉菌(Aureobasidium pullulans) vs Aspergilli carbonarius，或Candida magnus和清酒假丝酵母(Candida sake) vs塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)为减少病原菌定殖于葡萄和葡萄腐烂的一些例子。

出芽短梗霉菌除了能降低约30%曲霉菌属侵染，也分别在2005和2006年以99%和90%减少葡萄汁中赭曲霉素的污染。耐热克鲁维酵母(Kluyveromyces thermotolerans)在田间能100%控制A. carbonarius和A. niger的生长，能降低约80%的毒素的积累。

环境对生物防治剂的活性和归宿有大的影响，对葡萄/有益酵母/病原曲霉属系统也是如此。De Curtis等人证实温度和湿度对 2个出芽短梗霉菌菌株和1个美极梅奇酵母菌株对A. carbonarius的防治活性和黄曲霉素积累有影响，也分析了这些有益真菌在受损葡萄果实上的种群动态。发现温度比相对湿度对有益真菌的保护作用影响更大，适宜于病原菌的环境条件最不利于有益真菌的活性。

一些研究者报道使用不产生赭曲霉素的曲霉菌防治葡萄的 Aspergilli carbonarius。Aspergilli carbonarius的不产生毒素的菌株非常罕见，有时一些不产生赭曲霉素的菌株实际属于不同的黑曲霉品种。这些很少被分离的菌株可作为生物技术制剂用于食品工业和生物制剂防治葡萄园中赭曲霉素的产生。

在2015年，Ahmed等人首次报道了类阿达青霉(Penicillium adametzioides)能够限制病原菌的生长和赭曲霉素的产生，可作为潜在的防治产生赭曲霉素的Aspergilli carbonarius的生物制剂。需要进一步研究此菌株，详细了解降低赭曲霉素产生的机制，以及在天然环境中的行为和归宿。

3.2 苹果上的青霉菌

棒曲霉素是在苹果上、苹果汁和其他苹果产品中发现的重要真菌毒素，影响人类和动物的健康。其具有致畸、细胞毒性，对生殖有毒作用，主要由扩展青霉(Penicillium expansum)产生。

棒曲霉素污染特别受关注，主要因为对此毒素污染敏感的许多加工食品为婴儿食物。引起贮存腐烂的病原菌常常来自于田间或果园。产生毒素菌株的孢子出现于果树上的水果中，但一般在水果收获前它们不生长(或产生毒素)。良好的农业措施以及收获前的保护方法对阻止病原菌侵染植物和被侵染的水果进入食物链很重要。有关果树生长条件的数个因素可能影响真菌的侵染和苹果中毒素的产生，这些因素包括在生长季进行叶面肥钙喷雾或使用能降低获前病原菌侵染苹果的最少量氮。

图1 从环境(单个生物或群落水平)到综合植物/微生物系统的成功生物防治策略的假设理想途径流程图

可应用杀菌剂、生物防治剂、利用诱导抗性、好的收获措施、照射、热水和降温等获前和获后措施限制扩展青霉的侵染，很好地避免棒曲霉素污染苹果。杀菌剂是用于防治获前和获后扩展青霉引起的根腐病最常见的方法。然而，考虑到当前立法和民意，正在研究新的生物替代方法，如使用从植物和水果分离的对病原菌有拮抗作用的附生微生物。因此，在获前应用拮抗酵母是保护水果免受获后病原菌危害和毒素积累的最有发展前景的措施之一。

把从水果和叶表面分离的出芽短梗霉菌和黏红酵母(Rhodotorula glutinis)以及有益细菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株用于田间苹果树，能显著降低扩展青霉、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)和苹果炭疽病菌(Pezicula malicorticis)引起的病害伤口的大小和数量以及获后苹果腐烂病的发生。此外，当水果从田间转入低温贮存后，拮抗菌种群比对照处理要大。已评估了从健康苹果表面分离的Candida membranfaciens和胶红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)防治扩展青霉生长引起的苹果蓝莓病的效果。在联合培养中，拮抗菌对病原菌的生长抑制率 20%～60%，在挥发性代谢物试验中抑制率50%～90%，在无细胞代谢试验中抑制率55%～86%。另外，在室温(20 ℃)和贮存温度(5 ℃)，所有酵母能够减少被接种苹果上95%病斑面积。

已对来自比利时的异常毕赤酵母(Pichia anomala)菌株K研究了20多年。果园试验表明其能很好防治扩展青霉，气象条件的变化对种群密度和其效果有大的影响。有关环境条件对异常毕赤酵母作用的影响信息非常重要，因为可根据此决定在病原菌侵染前获前处理是否足以很快定殖于伤口，或获后再次处理以增加酵母种群密度是否是正确的做法。然而，需要进行更多的工作来评估获前生物防治剂对扩展青霉的效果，确定是否生物防治影响获后棒曲霉素的形成。

4 “组学”时代的生物防治

二代测序(Next Generation Sequencing, NGS)技术是植物防御和食品安全中有效的，仍在开发/应用的工具。生态基因组学可用于更好地了解有益真菌单菌株或群落水平的生态特征。此新研究领域可用于发现防治病害中真菌-植物和有益真菌-病原菌相互作用的主要分子机制、真菌适应环境的进化，发育和生态重要性状。

二代测序也有助于在分类和功能水平上研究真菌种群，更好地把生物防治剂融入天然微生物组，设计真菌混用等用途。扩增子测序技术、宏基因组测序和宏转录组学是实现此目标的最常见的3种方法。扩增子测序是基于靶标特定基因组区段(通常为ITS——真菌的内转录间隔区)的扩增和测序。宏基因组测序是基于全基因组鸟枪测序，导致短测序片段测序(short sequencing)进一步集结于重叠群(contig)。2种技术都能用来描述整个微生物群落，包括不可培养微生物和真菌。而宏转录组学也基于鸟枪测序，用于研究整个群落的基因转录。

用二代测序技术，主要扩增子方法进行数个研究，其结果能较完整地描述植物微生物群落的特征和这些群落对植物生长、植物健康和食品安全的影响。例如，用真菌内转录间隔区1 (ITS1)的高通量焦磷酸测序评估了不同种类树的叶际真菌群落组成，并由此列成表。也用相同的方法检测了这些可潜在被开发为生物防治剂的真菌种类。

由于全测序真菌基因组数量快速增加，包括众所周知的或有潜力开发为生物防治剂的菌株，基因工程技术的进步对了解这些真菌的生物学、完全开发和赋予新的特性或性状非常重要。基因组编辑是1种基因工程，可用于插入、取代DNA，或用人工工程核酸酶或“分子剪刀”从基因组去除 DNA。CRISPR-Cas9技术正成为触发或抑制特定基因的大众化工具，也已被成功用于粗糙链孢霉(Neurospora crassa)和Trichoderma reseei等丝状真菌。此方法可用于生物防治产生毒素的真菌等植物病原菌。

用基因工具操纵真菌的重要生物学功能，如毒素的产生或分子对植物病原菌的活性，而在被编辑基因组中没有留下外源DNA的痕迹，这为生产更好的生物防治剂打开了一扇新大门。这些包括不产毒或侵略性高的真菌寄生或竞争菌株，可作为增加食物安全的新工具。

5 结论和展望

联合国粮农组织估计到2050年世界人口将达到91亿，比现在增加34%，人口增长主要发生于发展中国家。为了保证食品安全，需要粮食生产增加70%。例如，每年的谷物生产需为今天的1.5倍(从21亿t增加到约30亿t)，每年肉类生产要翻倍。除了对粮食的需要增加外，粮食安全是另一巨大挑战。联合国粮农组织列出了保证全球粮食安全的3个必要条件：⑴ 促进技术改变和生产力增加；⑵ 支持贸易、市场和农民走向公平、竞争的全球系统，建立稳定的粮食市场；⑶ 投资持续的农业生产和农村发展。

投资持续发展的农业能够满足不断增长人口需求，逐渐生产出安全、高品质和不用农药的粮食和饲料。减少化学农药的使用有利于开发替代性害物管理策略，后者既可保护作物，也可保护施药工人健康。而微生物农药还可降低环境污染(土壤和水)或病原菌对杀菌剂抗性的产生等许多化学农药的负面影响。

获后病害会损害产品，造成巨大损失。特别是在发展中国家，没有适宜的贮存和运输条件，在收获和搬运期，不正确的处理方法可能会损害作物。虽然“获后”一词暗示病害出现于获后阶段，但这种病害的管理需要从获前田间开始。这是为了使收获中的病原菌接种体的量最少，以降低获后与其生长有关的风险，最终减少食品污染。

本文列举的所有案例都是有关田间获前使用有益真菌来阻止和管理贮存期毒素的积累。当然，并不是所有这些方案都能确定无疑地解决这个问题，但毫无疑问，这是发展趋势，科研人员已开始进行大量研究。众所周知，开发获前生物防治剂能确保应用有益生物防治植物病原菌时能较早定殖于植物或植物部分的竞争优势，也能成功防治获后作物产品不受产毒植物病原菌的危害，包括贮存霉菌。

能设想到此策略的进化吗？当然，有多种可能情况存在。管理植物病害的生物方法进化的假设的理想途径(也应用于管理获前产毒素的真菌)以图 4表示。从单个菌株到多种真菌合用来看，环境是决定其活性的主要因素。应用含有1个生物防治剂以上的制剂是多营养方法。这些生物防治剂对单个或多个植物病原菌有相加或协同效果，或增加了不同机制的单个菌株联用的生物产品(包括多个生物防治剂联用制剂)的防效。宏基因组法可能有助于弄清楚此群落的结构和群落中单个成分间，群落和寄主植物间，病原菌和生物防治剂间的相互作用机制。要确保防治策略的成功需要具备病原菌和生物防治剂的生态学知识，以及环境因素对二者的影响。更好地了解这些方面对开发防治病原菌的生物方法很重要。关于获前生物防治产毒素的真菌来说，宏基因组法集中研究与作物有关的群落(如田间水果上天然存在的)，有助于发现用于降低贮存期毒素积累风险的真菌混用中的一个或多个培养菌株。根据当前的法规，作为植物保护产品的真菌混用登记要求登记每个生物和整个真菌混用产品，其高昂的费用让大型农化公司都望而却步。

另一方面，可用基因编辑技术，特别是如删除(CRISPRCas9)等致突变技术提高有益菌株防效。当然，还没有有关这些策略——真菌联盟和被编辑的菌株归宿的信息，这些策略的应用将取决于立法限制/支持以及最后大众的接受程度。