西湖风景名胜区流浪猫弓形虫病流行病学调查

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(1.浙江大学动物科学学院，浙江杭州 310058；2.杭州动物园)

弓形虫病是一种由刚地弓形虫(Toxopasmagondii)感染引起的的专性细胞内寄生性原虫病，呈世界性分布。其宿主范围十分广泛，能感染包括人类在内的所有温血脊椎动物的有核细胞，故为人兽共患寄生虫病[1]。弓形虫最早于1908年由Nicolle和Manceaux在北非突尼斯的啮齿类梳趾鼠体内发现，现已分布于世界各地[2]。据统计，1985～2006年期间我国猫弓形虫感染率在14.06%～78%之间[3]。弓形虫在人群中的感染率相当高，全球约三分之一的人口被弓形虫感染，我国人群弓形虫血清抗体平均阳性率为7.88%[4，5]。人或动物误食被弓形虫卵囊、包囊、速殖子等污染的食物或者水，均有可能感染弓形虫[6,7]。弓形虫对人和动物危害严重，可导致孕妇流产、死胎、先天性畸形，也会造成免疫力低下[8]。动物慢性感染时一般无明显症状，这不仅给患病动物的诊断带来极大的困难，而且对公共安全存在潜在的威胁，因此，无论是就流浪猫本身的健康而言，还是考虑到景区游客健康，对西湖风景名胜区流浪猫弓形虫感染情况的调查显得尤其重要。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂 ID Screen toxoplasmosis indirect Multi-species试剂盒，IDvet innovative Diagnostics。TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒，天根生物有限公司。弓形虫PCR检测试剂盒，世纪元亨生物有限公司。

1.1.2采用仪器及器材 酶标仪购自Molecular Devices公司、Eppendorf排枪、Eppendorf移液枪(10 μL，200 μL，1000 μL)、恒温箱、Eppendorf 14000 rpm小型离心机、苏净安泰双人超净台，Scilogex 震荡仪，国华数显恒温水浴锅，Applied Biosystem Veriti型基因扩增仪，君意JY04S凝胶成像系统，BIO-RAD POWERPAC电泳系统。

1.1.3样本采集及处理 在2016～2017年期间共抽样采集杭州动物园、孤山公园、杭州少儿公园、虎跑公园内流浪猫34份血清样本，19份全血样本以及杭州动物园、孤山公园、六和塔公园、杭州少儿公园四处的环境样本33份。血清置-20℃冰箱，全血和环境样本置-40℃冰箱保存备检。

1.2方法

1.2.1间接酶联免疫试验(ELISA)法 用于分析检测血清样本中弓形虫抗体IgG。

1.2.1.1原理 用包被好弓形体P30抗原的微量板与样本中的抗体结合形成“抗原-抗体”复合物。若存在抗体，则呈现显色反应；若不存在抗体则不呈现任何显色反应，呈色反应与样本中抗体含量成正比。在450 nm波长检测OD值，计算每个样本(S/P)的百分比，即(S/P)%=(OD样本-OD阴性对照)/(OD阳性对照-OD阴性对照)。当(S/P)%≤40%时为阴性，当40%<(S/P)%<50%时为可疑，当(S/P)%≥50%时为阳性。

1.2.1.2检测步骤 样本准备、洗涤液准备、酶结合物准备、检测、测OD值。

1.2.2分子生物学鉴定方法 用于分析检测全血及环境样本中的弓形虫抗原。

1.2.2.1全血样本中基因组DNA提取 根据TIANamp Blood DNA Kit血液基因组DNA提取试剂盒提取动物全血样本中的DNA。

1.2.2.2环境样本中DNA提取 取1 g猫粪于水中充分混匀,离心去除上清。加入sheather’s 浮选液，将沉淀悬浮，混匀，低速离心除去非虫卵成分。取虫卵悬浮液，加水稀释后，高速离心，获得虫卵沉淀。

向虫卵分离物沉淀加入细胞裂解液与微型玻璃珠，在涡旋震荡仪上震荡破碎虫卵，释放虫卵内DNA。按照离心柱小提DNA的方法提取DNA。

1.2.2.3PCR扩增 分别用弓形虫PCR检测试剂盒中特异性上下引物对阳阴性对照物和全血和环境样本的DNA PCR扩增。反应条件为：94℃ 5 min，94℃ 45 sec，57℃ 30 sec，72℃ 1 min，32个循环；72℃ 10 min。

1.2.2.4电泳 配制1×TAE 电泳液若干，加入Gene Greed染液后制胶。然后取10 μL PCR扩增物在1.5%的琼脂糠凝胶上电泳30 min，最后通过凝胶成像仪进行拍照记录结果。

2 结果

2.1弓形虫抗体检测结果 流浪猫血清样本弓形虫抗体IgG检测结果，收集了34份流浪猫血清样本，流浪猫来源于生活在动物园(21份)、孤山(7份)、少儿公园和虎跑公园(6份)景区内，总的阳性检测率为20.59%(表1)，通过采集样本的季节性分析，春季(4/6)66.67%、夏季(2/10)20.00%、秋季(1/12)8.33%、冬季(0/6)0.00%(表2)。

表1 流浪猫弓形虫血清学检测情况

表2 流浪猫血清样本弓形虫抗体IgG季节性分析

2.2抗原检测结果

2.2.1全血样本抗原检测结果 部分全血样本PCR分析结果，流浪猫共检测19份，其中动物园的12份、孤山的7份，均为阴性(表3)。

表3 流浪猫全血PCR分析结果

2.2.2环境样本抗原检测结果 分别对动物园、孤山、六和塔、少儿公园和虎跑六处环境进行取样分析，共采集了33个样本，主要是在冬季(12至次年2月)采集的，其中动物园14份，孤山8份、六和塔3份、少儿公园5份、虎跑公园3份。在动物园有一份样本检测出阳性(见图1)。

图1 PCR扩增结果

3 讨论

3.1猫是弓形虫的终宿主，在猫小肠上皮细胞内进行裂殖体增殖和配子生殖，最后形成卵囊，随猫粪排出体外，卵囊在外界环境中经过孢子增殖发育为含有两个孢子囊的感染性卵囊[9]。人类可以通过接触感染弓形虫的猫，食被感染的生肉或未完全煮熟的肉，或者通过胎盘由母体垂直传播而感染弓形虫，还可以通过接触被弓形虫阳性猫粪便污染的宠物而感染[10]。现在游客投喂流浪猫的现象越来越普遍，因此，与游客关系密切的流浪猫，在弓形虫的传播过程中起着非常重要的作用 ，充分了解流浪猫的弓形虫发病及感染情况都具有重要的现实意义。

3.2弓形虫感染后IgG抗体在血液中一般1～2周出现阳性，3～5周抗体效价达到高峰，并可维持时间长，健康带虫者可长期保持IgG抗体[11]。从流浪猫分子生物学检测结果发现，其阳性率均比较低，但弓形虫抗体IgG的阳性率为20%以上，这原因可能以弓形虫生活史有关，也有可能以取样的数量有关，还需要进一步分析。血清弓形虫抗体IgG在体内维持时间较长，对于调查弓形虫感染情况来讲，相对于分子生物学检测，采用ELISA法检测动物血清抗体IgG是一个比较不错的调查方法。

3.3通过分析西湖景区内34份流浪猫血清弓形虫抗体IgG情况，发现其与浙江省感染率调查结果[9]差不多，具有一定的相关性，而比北京市感染率30.3%[12]要低。其中孤山流浪猫阳性率为(4/7)42.86%，比动物园、虎跑公园和少儿公园的都高。这可能跟流浪猫的密度有一定的关系，密度越大，相互接触传染的可能性大，感染率也随之变高。

3.4通过分析取样季节，发现血清弓形虫抗体IgG阳性率春季最高，为 66.67%；其次为夏季、秋季，冬季阳性率最低，在以后弓形虫防治方面，春季最关键。同时弓形虫抗体检测结果与环境样本分子生物学检测的结果比较吻合，由于环境样本在冬季比较好找，这次的样本基本是在12、1、2月份取的样，检出率不高可能也有这方面原因。