AKT1负性调控乳腺癌细胞迁移的机制研究*

张国燕， 李志凌， 曹 珅， 彭 婵， 卢 玥， 牛 杰， 席卓青， 张怡丹， 方 东， 谢松强

(河南大学药学院， 河南 开封 475004)

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，肿瘤转移则是导致乳腺癌患者死亡的主要原因[1]。在抗肿瘤新药研发中蛋白激酶B(protein kinase B, PKB; 又称AKT)小分子抑制剂已受到关注，然而有研究发现抑制AKT1的功能反而促进乳腺癌的转移[2-3]。但目前为止，AKT1负性调控乳腺癌转移的分子机制还不清楚。

β-连环蛋白(β-catenin)是一种分子量约92 kD 的多功能蛋白质。正常情况下，细胞内仅存在极少量的β-catenin，在细胞连接处作为一种细胞骨架蛋白参与细胞间的黏附，维持上皮的极性及完整性[4-5]。在异常情况下，细胞质中β-catenin蛋白的表达则会明显上调，过多的β-catenin 则可进入细胞核，启动基质金属蛋白酶等肿瘤转移相关基因的转录和表达[6-7]。但β-catenin核转位是否参与AKT1 负性调控乳腺癌转移还不清楚，本研究拟探究β-catenin的核转位是否参与了AKT1负性调控乳腺癌细胞的迁移。

材 料 和 方 法

1 细胞和试剂

人乳腺癌细胞株MCF-7 和MDA-MB-231均购自中国科学院细胞库。RPMI-1640培养基和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自四季青公司；二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、Hoechst 33342染料和XAV-939购自Sigma；免抗人β-catenin多克隆抗体、鼠抗人AKT1和β-actin单克隆抗体、鼠抗人lamin B1多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的 II 抗购自Santa Cruz； Alexa Fluor 488标记的荧光 II 抗购自Invitrogen；AKT1小干扰RNA(small interfering RNA, siRNA)购自Dharmacon，2条siRNA序列分别为5’-ACAAGGACGGGCACATTAA-3’(1#siAKT1)和5’-CAAGGGCACTTTCGGCAAG-3’(2#siAKT1)。

2 方法

2.1细胞培养与RNA干扰 细胞培养在含有10%胎牛血清、青霉素(1×105U/L)和链霉素(100 mg/L)的RPMI-1640培养基中，置于含5% CO2、 37 ℃细胞培养箱中孵育。当细胞密度达到70%时，参照Lipofectamine 2000说明书转染AKT1 siRNA, 转染24 h后进行后续实验。

2.2Western blot实验检测β-catenin总蛋白和核蛋白的表达 用RIPA(碧云天)裂解液提取肿瘤细胞的总蛋白，使用细胞核蛋白和细胞质蛋白提取试剂盒(碧云天)分离出核蛋白质。蛋白质的浓度是由BCA测定试剂盒(Pierce)测定。样品在95 ℃、 5×SDS-PAGE缓冲液中变性5 min。等量的蛋白使用10%的SDS-PAGE分离。然后转移到PVDF膜上，用5%脱脂奶在室温下封闭1 h。封闭之后，使用抗β-catenin和β-actin抗体在4 ℃下孵化过夜。用TBST洗过3次后，室温下用辣根过氧化物酶标记的 II 抗孵育1 h，采用ECL试剂盒显色检测。

2.3免疫荧光实验检测β-catenin蛋白的表达及定位 在小室玻片中以低密度接种的细胞用AKT1 siRNA处理24 h。在室温下，用4%多聚甲醛固定细胞10 min，然后用PBS洗5 min，5%牛血清白蛋白室温封闭1 h，4 ℃孵育抗β-catenin抗体 (1∶1 000) 过夜，然后用PBS 洗涤3 次，室温孵育Alexa Fluor 488标记的荧光 II 抗1 h，采用Hoechst 33342在室温下标记细胞核5 min，再用PBS 洗涤3 次，激光共聚焦显微镜拍照。

2.4Transwell实验检测乳腺癌细胞的迁移能力 迁移实验是在以碳酸酯膜(Corning)为材料，孔径为8 μm的24孔板里进行的。将对数生长期的乳腺癌细胞系经胰酶消化后用不含血清的培养基制成1×108/L 的单细胞悬液，接种200 μL 至Transwell小室上室，在Transwell小室的下室中加入600 μL 含10% FBS 的培养基，然后在上室转染AKT1 siRNA，37 ℃培养箱中孵育24 h 后拿出小室，用棉签擦去上室细胞，用4%的多聚甲醛固定小室膜下的细胞10 min，用含0.1%的结晶紫甲醇溶液染色20 min 后，PBS 洗3次，风干，然后在光学显微镜下计数。

3 统计学分析

用GraphPad Prism 5软件进行数据分析，所有数据都以均数±标准差(mean±SD)表示。多组间使用单因素方差分析；对于多组间多重比较，进行方差分析后各组均数间的两两比较采用SNK-q检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 敲减AKT1表达对β-catenin总蛋白表达的影响

MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞分别转染2条AKT1 siRNA (20 nmol/L) 24 h后，AKT1蛋白的表达均明显下调(P<0.01),见图1，并且β-catenin总蛋白的表达显著增加(P<0.05，P<0.01)，见图2。

2 敲减AKT1表达对乳腺癌细胞中β-catenin核蛋白的影响

当敲减MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中AKT1的表达后，细胞核中β-catenin蛋白的表达显著增加(P<0.01)，见图3。免疫荧光实验也显示，当敲减AKT1表达后，MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞中的β-catenin荧光染色明显增强，β-catenin蛋白会在细胞核中集聚，见图4。

3 β-catenin蛋白的核积聚对乳腺癌细胞迁移能力的影响

当敲减AKT1表达后，MCF-7细胞和MDA-MB-231细胞的迁移能力明显增强，而端锚聚合酶抑制剂XAV-939可以明显逆转敲减AKT1表达诱导的乳腺癌迁移能力的增强(P<0.01)，见图5。

讨 论

AKT是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，其家族成员主要有3个，分别是AKT1、AKT2和AKT3，其基因分别定位于人染色体的14q32、19q13和1q44区域[8]。这3个成员结构相似，在蛋白一级结构上具有80%以上的同源性。大量文献显示AKT在肝癌、乳腺癌以及甲状腺癌等多种恶性肿瘤中以异常活化形式存在，可促进肿瘤细胞的生长及增殖，因而AKT已成为抗肿瘤药物研发的重要靶点，例如一些广谱的AKT抑制剂AZD5363、Afuresertib和MK2206等已经作为抗乳腺癌、胃癌、骨髓瘤和前列腺癌的药物进入到临床试验阶段[8-9]。然而，越来越多的研究发现AKT家族的成员AKT1在乳腺癌及前列腺癌的增殖和转移过程中有着不同的作用[10-11]，如AKT1的激活可以促进乳腺癌和前列腺癌细胞的增殖，但抑制了肿瘤细胞的迁移和侵袭；相反，当AKT1功能受到抑制后，乳腺癌和前列腺癌的生长虽然会受到明显抑制，而转移能力则明显增强。这将带来临床合理用药问题，即广谱的AKT 抑制剂在抑制乳腺癌细胞增殖的同时很可能会导致癌细胞的转移。

Figure 1. The protein expression of AKT1 in the MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells after transfected withAKT1 siRNA. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

Figure 2. The total protein expression of β-catenin in the MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells after transfected withAKT1 siRNA. Mean±SD.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

Figure 3. The expression of nuclear β-catenin protein in the MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells after transfected withAKT1 siRNA. Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group.

Figure 4. Immunohistochemical staining of β-catenin (green) in the MCF-7 cells and MDA-MB-231 cells after transfected withAKT1 siRNA (×120). The cell nuclei were stained with Hoechst 33342 (blue).

Figure 5. The effects of XAV-939 (XAV) on the enhanced migration ability of MCF-7 cells (A and B) and MDA-MB-231 cells (A and C) induced by AKT1 inhibition (×20). Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vs1#siAKT1 group;△△P<0.01vs2#siAKT1 group.

最近，Li等[12]发现在乳腺癌中使用MK-2206抑制AKT1，可通过降解磷酸化依赖的Twist1诱导上皮-间充质转化。然而，AKT1功能抑制导致的乳腺癌转移能力增强的机制仍然不清楚。本研究证明β-catenin蛋白的核聚集介导了抑制AKT1诱导的乳腺癌转移。β-catenin蛋白是细胞间黏附结构的主要组成部分，可通过核移位进入细胞核促进肿瘤的转移[13-14]。有文献显示广谱的PI3K抑制剂GDC-0941可通过刺激Wnt的转录，促进乳腺癌细胞中β-catenin的核移位[15]。AKT1作为PI3K下游的信号分子，AKT1抑制剂很可能也是通过刺激Wnt的转录导致β-catenin核移位的。然而这种推论是否正确，尚需要进一步的实验进行验证。当然在肝癌、胃癌以及甲状腺癌中，我们认为这种推论是不存在的，因为在这些肿瘤细胞中抑制AKT功能会导致β-catenin蛋白的水解，究其原因很可能是因为AKT1在不同的肿瘤中的作用是不同的。