HPLC法测定克班宁脂质体中克班宁的含量

云南中医学院中药学院，云南 昆明 650500

克班宁(Crebanine，Cre)是由防己科千金藤属植物“山乌龟”中提取得到的异喹啉类阿朴菲型生物碱。前期研究发现[1-2]其具有较强的心血管药理活性，对多种实验性心律失常具有较强的对抗作用，且起效迅速，维持时间较短，是值得深入研究开发的生物活性物质。由于前期研究[3-5]已发现克班宁具显著活性的同时也有较明显的毒性，故研究将克班宁制成脂质体，使其毒性降低，安全有效地发挥其抗心律失常作用。本实验采用HPLC方法测定脂质体中克班宁的含量，操作简便，结果准确，重现性好，为克班宁脂质体的质量标准提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Agilent 1 100高效液相色谱仪(自动进样器、二级管阵列检测器、恒温柱温箱)， C18色谱柱(Diamonsil C18, 4.6 mm×250 mm，5 μm)； 电子天平(Sartorius BT 25 s)，SK 250 HP 超声清洗仪(上海科导超声仪器有限公司)。

1.2 材料 克班宁对照品(自制[6])；大豆磷脂(批号：20140202，上海太伟药业有限公司)；胆固醇(批号：20110708，中国新兴化工试剂研究所)；克班宁脂质体属于自制；甲醇、三乙胺等流动相所用试剂均为色谱纯，其余均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 克班宁脂质体的制备 采用逆向蒸发法制备空白脂质体，处方按照大豆卵磷脂、胆固醇质量比5∶1，并用适量氯仿溶解，加入量取一定量的pH为3的柠檬酸水溶液，超声混匀成W/O型乳剂，置旋转蒸发仪上30℃恒温水浴减压蒸发除去氯仿，得空白脂质体混悬液。以药值比1∶4取适量盐酸克班宁与空白脂质体混合均匀并用Na2HPO4调pH至5.8，50℃恒温水浴20 min，即得克班宁脂质体。

2.2 样品溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取克班宁(含量94.1%)0.3 g置100 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得。

2.2.2 供试品溶液 取“2.1”项下克班宁脂质体1 mL置10 mL容量瓶中，用甲醇超声溶解，并稀释至刻度，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，取续滤液，作为供试品。

2.2.3 阴性对照品溶液 精密称取卵磷脂3.3 mg,胆固醇0.67 mg置10 mL容量瓶中，加甲醇超声溶解，并稀释至刻度，摇匀，即为阴性对照品。

2.3 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Diamonsil C18( 4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：甲醇-0.008%三乙胺水(75∶25)；流速为1.0 mL/min；柱温：30℃；检测波长：280 nm。

在上述色谱条件下，取克班宁标准品，克班宁脂质体供试品及阴性对照品，分别取10 μL注入液相色谱仪进行测定。系统适应性测定结果(见表1)。克班宁的分离度大于9.10，理论塔板数按克班宁计算不少于5 000，克班宁的拖尾因子为1.08。结果表明：样品中克班宁的色谱峰分离度、拖尾因子均能满足《中国药典》2010年版一部附录ⅥD高效液相色谱法项下规定，理论板数按克班宁计算均大于5 000，因此该色谱条件适合于克班宁脂质体的分析，色谱图如图1所示。

2.4 线性关系考察 取“2.2”项下克班宁对照品，依次精密吸取0.1、0.2、0.4、0.5、1、2、3 mL的上述标准品溶液置于5 mL的容量瓶中加甲醇定容，即得浓度为0.06、0.12、0.24、0.30、0.60、1.20、1.80 mg/mL的克班宁系列标准品。分别精密吸取克班宁系列标准品溶液各10 μL注入液相色谱仪，照上述色谱条件测定峰面积，以峰面积(A)为纵坐标，进样量(C)为横坐标，绘制标准曲线，并计算回归方程。结果克班宁的回归方程为A= 1839.6C-604.65 (r=0.999)，线性范围为0.06～1.8 mg；表明克班宁在线性范围内峰面积与进样量有良好的线性关系。

表1 系统适用性试验结果

2.5 精密度试验 分别精密吸取“2.2”项下供试品溶液各10 μL，重复进样5次，测定峰面积，结果峰面积的RSD为0.007924%，小于3%，结果表明精密度良好。

2.6 稳定性试验 取“2.2”项下供试品溶液，在0、2、4、6、8 h分别进样10 μL，测定峰面积，结果RSD值是0.024333%，小于3%，所以标准品溶液在8 h内稳定。

2.7 重复性试验 取同一批次供试品6份，按照“2.2”项下方法，分别精密量取1 mL，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，分别经微孔滤膜(0.45 μm)，过滤后再分别进样10 μL，结果6份样品的平均RSD是0.303%小于5%，表明本法具有较好的重现性。

2.8 加样回收率试验 取“2.2”项下的标准品精取3 mL分别用甲醇定容于10 mL、50 mL、100 mL的容量瓶中，配得高(881.1 μg/mL)，中(440.55 μg/mL),低(88.11 μg/mL)克班宁对照溶液，分别取克班宁对照低、中浓度和高浓度各2 mL置于10 mL容量瓶中，再分别加入克班宁脂质体样品(2.81 mg/mL)3 mL于容量瓶，用甲醇定容，摇匀，经微孔滤膜(0.4 μm)过滤后再分别取10 μL注入液相色谱仪，照该品含量测定方法，测定含量，计算平均回收率为101.56%，RSD值为6.77%。表明本实验回收良好。见表2。

2.9 样品测定 取克班宁脂质体4批，依上述HPLC法测定克班宁脂质体中克班宁含量，每份样品测定两次，结果4批样品平均含量的53.95%，为后期研究工作提供研究方法。

表2 克班宁脂质体溶液加样回收率试验结果

3 讨论

脂质体作为新型药物输送系统，具有类细胞结构，能使药物延长药效、改变被包封药物的体内分布，提高药物的治疗指数，减少药物的治疗剂量和降低毒性。而克班宁毒性大、在动物体内为超速处置类(t1/2<1 h)药物，利用脂质体作为输送介质，达到延长药效和降低毒性的目的。为后期克班宁在抗心律失常的应用提供基础研究。采用HPLC对克班宁脂质体进行含量测定，操作简便，结果准确，重现性好，可用于克班宁纳米脂质体的质量控制。在实验中，参照文献[7]流动相比例进行含量测定，而因脂质体膜材料即卵磷脂和胆固醇的影响，最终以甲醇-0.008%三乙胺水比例是75∶25能得到理想的分离效果。为克班宁脂质体的后续研究奠定基础。