HPLC检测黑皮鸡枞菌中的水溶性维生素

李艳

（1.河北科技大学生物科学与工程学院，河北石家庄050018；2.河北省发酵工程技术研究中心，河北石家庄050018）

鸡枞菌（Termitomyces spp.）又叫伞把菇、鸡丝菇、蚁巢伞、三坛菌等[1-2]，隶属于担子菌亚门，层菌纲，伞菌目，口蘑科，是一种味道鲜美、营养丰富的珍贵野生食用菌[3-4]，主要分布在南亚、东亚、非洲以及南太平洋岛屿等热带和亚热带地区，我国云南省是世界鸡枞菌的主要分布区域之一，种类丰富且产量较大。维生素是一种维持机体正常生理功能所必须的营养物质[5]，它不是构成机体组织和细胞的原料，也不是能量的主要来源，而是一种在物质代谢中起重要作用的调节物质。绝大多数维生素在体内不能合成或合成量很少，不能满足机体的需求，需要通过额外摄入食物来补充，尽管机体需求量很少但一旦摄入量不足就会引起相应的维生素缺乏症，造成机体的损伤。按照维生素的溶解性可分为水溶性和脂溶性两类，水溶性维生素主要包括维生素C和部分B族维生素（维生素B1、维生素 B2、维生素 B6、维生素 B12、烟酸、叶酸和泛酸），脂溶性维生素包括维生素A、维生素D、维生素E、维生素K等。检测维生素的方法主要有分光光度法[6]、荧光分析法[7]、薄层层析法[8]和液相色谱法[9-12]等。高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）操作简单、特异性强、准确度高是目前检测食品中水溶性维生素最常用的方法。大量文献[13-14]针对鸡枞菌中的蛋白质、氨基酸、脂肪、总糖、还原糖、灰分和矿物元素等基础成分进行了分析研究，至今未见对鸡枞菌中维生素类营养成分的分析报道。本研究旨在建立采用HPLC同时定性、定量分析检测新鲜黑皮鸡枞菌和菌粉中7种水溶性维生素的方法，为其深度开发与利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜黑皮鸡枞菌和菌粉均由河北灵济食用菌有限公司提供。

维生素C标品（分析纯）：天津博迪化工股份有限公司；维生素 B1、维生素 B2、维生素 B6、维生素 B12、烟酸、叶酸标品（分析纯）：美国Sigma公司；磷酸二氢钾、氢氧化钠、三乙胺（分析纯）：天津永达化学试剂有限公司；甲醇（色谱纯）：天津星马克科技发展有限公司；试验用水为娃哈哈纯净水。

1.2 仪器与设备

SHIMADZU高效液相色谱仪（HPLC）LC-20A、Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱：日本岛津公司；Spectrum 756p紫外可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；SHZ-Ш循环水式多用真空泵：上海知信实验仪器技术有限公司；DELTA320pH计：梅特勒·托利多仪器有限公司；ARI140型电子分析天平：美国奥豪斯仪器有限公司；微孔过滤器：天津市南开区百顺百通仪器设备销售部。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

流动相的配制：称取6.8 g KH2PO4，溶于1 000 mL水中，得到0.05 mol/L的KH2PO4溶液[15]，用三乙胺调节pH=6.0。流动相使用前用0.45 μm膜过滤后超声脱气15 min。

标准储备液的配制：分别称取维生素C、维生素B1、维生素B2、维生素B6、维生素B12、烟酸和叶酸标准品各 10 mg，维生素 C、维生素 B1、维生素 B6、维生素 B12、烟酸直接用水溶解后定容到10 mL棕色容量瓶中，维生素B2和叶酸先用少量0.1 mol/L的NaOH溶液溶解后再用水定容到10 mL棕色容量瓶中，得到浓度均为1 mg/mL的标准品储备液，储存于4℃冰箱中备用[16]。

混合标准使用液的配制：分别吸取维生素B1、维生素B12标准储备液各0.8 mL，维生素B6、烟酸和叶酸标准储备液各0.4 mL，维生素C、维生素B2标准储备液各0.1 mL混合在一起得到混合标准使用液，再用水稀释到所需的浓度，进样前过0.45 μm膜。

1.3.2 样品的制备

新鲜黑皮鸡枞菌样品处理：随机挑选新鲜的黑皮鸡枞菌，分成菌盖、菌腿和完整菌3份样品，分别切丁，打浆或充分研磨，称取适量样品，加45 mL水进行超声提取30 min，4 500 r/min离心15 min，用布氏漏斗过滤，取滤液定容到50 mL，过0.45 μm膜过滤，进样。

黑皮鸡枞菌菌粉的处理：称取适量菌粉，加45mL水超声提取30 min，4 500 r/min离心15 min，用布氏漏斗过滤，取滤液定容到50 mL，过0.45μm膜过滤，进样。

1.3.3 色谱条件

流动相：A 为 0.05 mol/L KH2PO4溶液（pH=6.0）；B为甲醇；流速：0.8 mL/min；柱温：室温；检测波长：268 nm；进样量：20 μL；梯度洗脱，洗脱程序见表1。

表1 梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution program

1.3.4 维生素标准曲线的绘制及检出限和定量限

取一定量的混合标准使用液稀释成6个不同浓度值，每个浓度值重复进样3次取平均值，以响应值峰面积y对质量浓度x作线性方程：y=ax+b，进行线性回归分析。检出限（limit of determination，LOD）为3倍信噪比，定量限（limit of quantification，LOQ）为 10倍信噪比。

1.3.5 精密度和回收率

精密度：取20 μg/mL的混合标准使用液连续进样6次，以峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）来表征方法的精密度。

回收率：采用不含维生素的样品为基质进行空白加标，分3个浓度值，以外标法计算加标回收率，每个浓度值重复进样5次，以加标回收率来表征方法的准确性。

1.4 数据处理

色谱数据分析采用仪器自带软件进行处理。所有线性方程、精密度及回收率试验的数据均由Excel 2007处理得出。

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

2.1.1 检测波长的选择

通过紫外可见分光光度计对7种水溶性维生素标品溶液进行全波长扫描，最佳吸收波长见表2。

表2 维生素最佳吸收波长Table 2 The best absorption wavelength of vitamins

由表2可知7种水溶性维生素的最佳吸收波长虽不一致，但较为接近，在270 nm左右均有较高的吸光度，因此本研究确定试验的最终检测波长为268 nm。

2.1.2 色谱柱的选择

试验比较了 Hypersil ODS2（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱和 Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱对7种水溶性维生素的分离效果，结果表明使用Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱时，7种维生素实现了良好的分离，分离度大于3且峰形尖锐，因此试验最终选择 Inertsil ODS-SP（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱。

2.1.3 流动相pH值的确定

流动相的pH值是影响维生素分离的一个重要因素，试验研究了不同pH值的流动相KH2PO4溶液对7种水溶性维生素的分离效果，结果表明当pH<6时维生素B1和维生素B6不能完全分离，当pH=6时7种水溶性维生素实现了良好的分离，当pH>6时7种水溶性维生素虽能分离但峰面积有减少的趋势，且部分维生素特别是维生素C在偏中性条件下不稳定，综合考虑最终确定流动相的pH=6。在调节pH值时，试验比较了0.1 mol/L的NaOH溶液和三乙胺对分离效果的影响，结果表明使用三乙胺调节pH值时，操作更简单且峰形明显优于NaOH溶液。

2.1.4 流速和柱温的选择

研究比较了流动相的流速对7种水溶性维生素分离效果的影响，结果表明，在流速分别为0.6、0.8、1.0 mL/min选择时，流速为0.6 mL/min分离时间较长且出峰时间靠后；流速为0.8 mL/min和1.0 mL/min时，7种维生素均可在22 min内实现良好分离，考虑到流速越大泵压越高，对色谱柱和仪器损伤较大，因此最终确定流速为0.8 mL/min。改变柱温发现除了保留时间略微缩短之外对维生素的分离和定性定量分析没有明显的影响，因此选择在室温条件下操作。

2.1.5 梯度洗脱程序的优化

试验首先研究了在等度洗脱条件下7种维生素的分离效果，结果发现调节有机相的浓度进行等度洗脱不能实现维生素的良好分离，因此改为梯度洗脱，并通过对梯度洗脱程序的不断优化最终确定了表1所示的洗脱程序，7种维生素在22 min之内实现了良好分离，且分离度都大于3。

通过对色谱条件的优化，7种维生素实现了分离和同时检测，结果见图1。

由图1可知7种维生素均达到了基线分离，可用于维生素的定性定量分析。

2.2 维生素检测方法的建立

2.2.1 维生素标准曲线的绘制及检出限和定量限

按照最优色谱条件对各维生素标品进行HPLC分析，各维生素的线性相关系数R2、线性范围、检出限LOD、定量限LOQ如表3所示。

图1 维生素标准品色谱图Fig.1 Standard chromatogram of vitamin

表3 各维生素的线性相关系数、线性范围、LOD、LOQ及RSDTable 3 The linear correlation coefficient，linear range，detection limit，quantitative limit and relative standard deviation of each vitamin

由表3可知各维生素的线性相关系数在0.999 6～1.000 0之间，表明线性关系良好，最低检出限在0.15 μg/mL～1.52 μg/mL 之间，定量限在 0.49 μg/mL～5.08 μg/mL 之间。

2.2.2 精密度和回收率

以峰面积的相对标准偏差RSD来表征方法的精密度，以不含维生素的样品为基质进行空白加标计算加标回收率，以加标回收率来表征方法的准确性，结果见表4。

表4 各维生素的加标回收率Table 4 Standard addition recovery rate of each vitamin

由表4可知7种维生素的RSD在0.31%～7.04%之间，表明精密度良好[17-18]。由表4可知7种维生素的加标回收率在88.07%～106.01%之间，回收率较高[19-20]，说明方法的准确性良好。

2.3 鸡枞菌中水溶性维生素含量的测定

按照1.3.2所述方法对样品进行处理后，按照所建立的方法对样品进行检测，以保留时间进行定性，以外标法进行定量，新鲜黑皮鸡枞菌及菌柄、菌伞和菌粉中水溶性维生素含量的检测结果见表5。

表5 鸡枞菌中水溶性维生素含量Table 5 The content of water soluble vitamin in Termitomyces spp.

由表5可知，新鲜黑皮鸡枞菌中检测到4种水溶性维生素，菌粉中检测到5种水溶性维生素且都以维生素C和烟酸为主。新鲜黑皮鸡枞菌及菌粉中维生素C和烟酸总量分别占总维生素含量的86.47%和87.97%，其中维生素C的含量分别占总维生素含量的59.37%和50.62%，维生素C能够维持免疫功能，保持血管完整，促进非血红素铁的吸收，同时维生素C还具有抗氧化，抗自由基，抑制酪氨酸酶的形成等功能，从而达到美白，淡斑的功效。烟酸的含量分别占总维生素含量的27.10%和37.35%，烟酸有较强的扩张周围血管的能力，能维持消化系统的健康、减轻胃肠道障碍，同时还可以预防和缓解严重的偏头痛且对缓解皮炎和腹泻症状具有明显的效果。由此可见，多食用以鸡枞菌为主要原料的产品对于维持机体正常功能、保护胃肠道和美白养颜等具有重要作用。菌粉中叶酸含量占总维生素含量的1.82%，而新鲜黑皮鸡枞菌中未检测到叶酸，可能是由于新鲜黑皮鸡枞菌中叶酸含量过低超出了该方法的检出限。

完整的黑皮鸡枞菌主要由菌柄和菌伞两部分组成，菌柄和菌伞也都检测到4种水溶性维生素且都以维生素C和烟酸为主。菌柄和菌伞中维生素C和烟酸总量分别占总维生素含量的88.57%和86.92%，其中维生素C含量分别占总维生素含量的52.90%和64.47%，烟酸含量分别占总维生素含量的35.67%和22.45%。进一步分析发现菌伞中维生素C的含量是菌柄中维生素C含量的1.48倍，维生素B2含量是菌柄中含量的3.40倍；菌柄中烟酸含量是菌伞中烟酸含量的1.31倍，维生素B1含量是菌伞中含量的1.22倍。菌伞中总维生素含量是菌柄中总维生素含量的1.21倍。以上数据为黑皮鸡枞菌不同部位营养价值的开发提供了理论依据。

3 结论

本试验建立了一种简单、快速、准确并可同时检测7种水溶性维生素的方法，利用此方法对新鲜黑皮鸡枞菌、菌粉、菌柄和菌伞进行定性和定量分析，结果表明黑皮鸡枞菌水溶性维生素含量丰富且以维生素C和烟酸为主，维生素C和烟酸对于维持机体正常功能、保护胃肠道和美白养颜等具有重要作用。检测方法的建立和检测数据结果为黑皮鸡枞菌的开发利用和深度加工奠定了一定的理论基础。