余甘子多糖体外降血糖及抗氧化活性研究

（昭通学院化学与生命科学学院，云南昭通657000）

余甘子（Phyllanthus emblica L.）是大戟科（Euphorbiaceae）叶下珠属（Phyllanthus）余甘子的果实，主产于热带、亚热带地区。余甘子性凉、味甘，可清热凉血、生津止咳、健胃消食、保肝、降压等。余甘子是一种重要的药食两用植物资源，余甘子含有丰富的维生素、黄酮、皂苷、多酚及多糖等活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、抑制病毒、增强免疫力、降血糖等生物活性[1-6]。云南是全国余甘子分布最广，产量最高的省份之一，年产鲜果约10万吨[7]。目前，云南省的余甘子资源尚未充分开发利用，余甘子多以未经过深加工的余甘子粉、余甘子果脯、余甘子饮料等形式出售，产品附加值低。本试验对余甘子多糖进行了体外降血糖及抗氧化活性研究，为其在保健食品中的开发利用提供一定理论依据，以促进地方特色植物资源的综合开发。

1 材料与仪器

1.1 材料与试剂

余甘子鲜果：云南省楚雄市；1，1-二苯-2-苦肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-N-tro phenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG）：美国 Sigma公司；阿卡波糖（Acarbose）：德国拜耳公司；其余试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

DZF-6210真空干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；JHF-350A型高速多功能粉碎机：昆明铁申商贸有限公司；SK5200LHC超声波洗涤器：上海科导超声仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；PHS-25数显pH计：上海精密科学仪器有限公司；UV/VIS2802PCS紫外-可见分光光度计：尤尼柯上海仪器有限公司。

2 方法

2.1 余甘子多糖制备

将新鲜余甘子清洗去核，70℃烘干粉碎，过40目筛，加入30倍体积80%乙醇，超声（53 kHz，250 W）浸提，除去其中的脂类、色素、单糖等成分，抽滤、晾干回收粉末；按料液比 1∶30（g/mL），向粉末中加入去离子水，置于100℃水浴中浸提90 min，抽滤得滤液，将滤液真空浓缩至一定体积，向浓缩液中加入无水乙醇使乙醇浓度为80%，充分搅拌，密封放入4℃冰箱静置24 h，离心分离得沉淀；所得沉淀加入适量去离子水溶解，用Sevag试剂（体积比1∶4氯仿正丁醇混合液）除蛋白，将脱蛋白后的溶液进行二次醇沉，沉淀用无水乙醇洗涤3次，真空干燥，得余甘子多糖。

2.2 余甘子多糖含量测定

采用苯酚-硫酸比色法，测定余甘子多糖含量[8-9]。分别准确量取50 μg/mL葡萄糖对照品溶液0.0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mL 于试管中，补充去离子水至溶液体积为1.0 mL，加入6%苯酚溶液1 mL，摇匀，浸入冰水浴中，分别加入4 mL浓硫酸，摇匀，置于沸水浴反应15 min，取出迅速冷却，室温平衡5 min，用未加对照品的空白溶液作参比，490 nm波长处测吸光度值，以对照品质量浓度X（μg/mL）为横坐标，吸光度值Y为纵坐标，建立标准曲线，得回归方程：Y=0.0114X-0.0203，r=0.999 3。同法测定样品的吸光度值，根据回归方程，计算出样品中多糖含量。

2.3 余甘子多糖降血糖活性测定

α-淀粉酶抑制剂和α-葡萄糖苷酶抑制剂可通过延缓人体肠道对淀粉等物质的降解和葡萄糖的消化、吸收，抑制餐后血糖升高，从而有助控制糖尿病及其并发症的发生与发展[10]。通过体外抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性试验测定余甘子多糖的降血糖作用，并与阿卡波糖做阳性对照进行比较。

2.3.1 α-淀粉酶抑制活性测定

采用 3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法测定α-淀粉酶抑制剂活性[11]。取适量待测样品溶液于试管中，补充50 mmol/L，pH6.8磷酸钠缓冲液至1.0 mL，加入10 U/mL，α-淀粉酶溶液1 mL，37℃孵育10 min，加入1%淀粉溶液1 mL，37℃孵育5 min，加入DNS试剂[12]1 mL置于沸水浴中反应5 min，冷水浴迅速冷却，加3 mL去离子水稀释后540 nm波长处测吸光度值。每个样品重复3次取平均值，酶活性抑制率按（1）式计算。以样品质量浓度为横坐标，酶活性抑制率为纵坐标，用origin软件绘制抑制曲线图，求出相应的半数抑制浓度（IC50）值。

式中：ODx为待测溶液的吸光度值；ODxo为待测溶液的本底吸光度值；ODo为空白对照溶液的吸光度值；ODoo为空白对照溶液的本底吸光度值。

2.3.2 α-葡萄糖苷酶抑制活性测定

参考文献[13]的方法，并有所改变。以PNPG为底物，在试管中加入一定量不同浓度待测溶液，补充50 mmol/L，pH6.8磷酸钠缓冲液至3.0 mL，加入α-葡萄糖苷酶（终浓度为7.5 U/mL）与PNPG（终浓度为2.5 mmol/L）各0.5 mL，混匀，37℃恒温反应30 min后，加入1 mol/L碳酸钠溶液1 mL终止反应，置于405 nm波长处测定吸光度值。每个样品重复3次取平均值，酶活性抑制率按（1）式计算。用origin软件绘制抑制曲线图，求出相应的IC50值。

2.4 余甘子多糖抗氧化活性测定

采用羟自由基（·OH）、超氧自由基（O2-·）和 1，1-二苯-2-苦肼自由基（DPPH·）清除法测定余甘子多糖的抗氧化活性，并以维生素C做阳性对照进行比较。

2.4.1·OH清除活性测定

取2 mmol/L硫酸亚铁溶液和6 mmol/L水杨酸溶液各3 mL于10 mL比色管中，加入不同浓度的待测溶液0.1 mL，补充去离子水至8.5 mL，最后加入17.6 mmol/L过氧化氢溶液1.5 mL启动反应，37℃恒温反应30 min，取出，室温平衡5 min，置于510 nm波长处测吸光度值[14]，每个样品重复3次取平均值，自由基清除率按（2）式计算。以样品质量浓度为横坐标，自由基清除率为纵坐标，用origin软件绘制清除曲线图，求出相应的IC50值。

式中：Ax为待测溶液后的吸光度值；Axo为待测溶液的本底吸光度值；Ao为空白对照溶液的吸光度值；Aoo为空白对照溶液的本底吸光度值。

2.4.2 O2-·清除活性测定

采用邻苯三酚自氧化法[15]。在试管中加入不同浓度待测溶液1 mL及50 mmol/L，pH8.2的三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲溶液5.0 mL，混匀，25℃水浴中预热20 min，加入25℃预热20 min的100 mmol/L邻苯三酚溶液0.5 mL，摇匀，25℃水浴反应30 min后用0.2 mL，10 mol/L盐酸终止反应，置于420 nm波长处测吸光度值。每个样品重复3次取平均值，自由基清除率按（2）式计，并用origin软件求出IC50值。

2.4.3 DPPH·清除活性测定

参照文献[5]的方法，测定余甘子多糖对DPPH·清除作用。每个样品重复3次取平均值，代入（2）式计算自由基清除率，并用origin软件求出IC50值。

3 结果与分析

3.1 余甘子多糖含量

按照前述多糖提取和测定方法，测得纯化余甘子多糖得率为6.51%；以葡萄糖计，纯化余甘子多糖中的多糖含量为48.94%，较高路等[16]所测含量（44.62%）高，说明该提取方法更有利于余甘子中多糖的浸提。

3.2 余甘子多糖的降血糖活性

3.2.1 对α-淀粉酶的抑制作用

余甘子多糖及阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制作用见图1。

图1 余甘子多糖对α-淀粉酶的抑制作用Fig.1 Inhibitory effect of Phyllanthus emblica L.polysaccharide on α-amylase

如图1所示，低浓度时，阿卡波糖对α-淀粉酶的抑制作用快速增加，IC50值为0.45 mg/mL，但随着浓度增高，其抑制作用变化平缓，最大抑制率约为74%；而余甘子多糖在质量浓度0.50 mg/mL～4.00 mg/mL时，能剂量依赖性地抑制α-淀粉酶活性，其IC50值为1.67 mg/mL，当质量浓度为4.00 mg/mL，抑制率即可达到96.47%，若继续增加浓度，余甘子多糖几乎可完全抑制α-淀粉酶活性。因此，余甘子多糖是一种理想的α-淀粉酶抑制剂。

3.2.2 对α-葡萄糖苷酶的抑制作用

不同浓度余甘子多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用见图2。

图2 余甘子多糖对α-葡萄糖苷酶的抑制作用Fig.2 Inhibitory effect of Phyllanthus emblica L.polysaccharide on α-glucosidase

如图2所示，在试验质量浓度0.75 mg/mL～1.625 mg/mL，余甘子多糖对α-葡萄糖苷酶具有一定抑制活性，且抑制作用与质量浓度呈良好的量效关系，其IC50值为0.89 mg/mL，当浓度为1.625 mg/mL时，抑制率可达95.46%；而阳性对照阿卡波糖虽低浓度时对α-葡萄糖苷酶抑制作用强，IC50值为0.04 mg/mL，但当浓度高于0.5 mg/mL时，抑制率不再增大，维持在86%左右，最大抑制率低于余甘子多糖。因此，余甘子多糖是一种较好的α-葡萄糖苷酶抑制剂。

3.3 余甘子多糖的抗氧化活性

3.3.1 对·OH的清除作用

自由基清除率越高表明提取物抗氧化活性越强，余甘子多糖对·OH清除作用见图3。

图3 余甘子多糖对·OH的清除作用Fig.3 Scavenging effect of Phyllanthus emblica L.polysaccharide on·OH

如图3所示，试验浓度范围内，随着浓度的增大，余甘子多糖对·OH的清除作用增强，呈现一定的量效关系，在0.68 mg/mL达到最大值63.14%，IC50值为0.45 mg/mL；维生素C在0.35 mg/mL时清除率达到了98.90%，IC50值为0.16 mg/mL。表明，余甘子多糖对·OH具有一定的清除能力，但较维生素C的清除能力弱。

3.3.2 对O2-·的清除作用

余甘子多糖和维生素C对O2-·清除作用见图4。

图4 余甘子多糖对O2-·的清除作用Fig.4 Scavenging effect of Phyllanthus emblica L.polysaccharide on O2-·

如图4所示，在试验浓度范围内，维生素C对O2-·清除率基本上不随浓度的变化而变化，均接近100%；而余甘子多糖随着浓度的增大，清除率增强，余甘子多糖与清除率二者之间存在较好的剂量依赖性，其IC50值为2.32 mg/mL，最大抑制率为88.52%，表明余甘子多糖对O2-·的清除活性弱于维生素C。

3.3.3 对DPPH·的清除作用

余甘子多糖对DPPH·的清除作用见图5。

图5 余甘子多糖对DPPH·的清除作用Fig.5 Scavenging effect of Phyllanthus emblica L.polysaccharide on DPPH·

由图5可知，在质量浓度6.00 mg/L～31.00 mg/L，余甘子多糖对DPPH·的清除作用随质量浓度的增大而迅速增强，之后对DPPH·清除作用达到饱和状态，清除率随浓度变化趋于平稳。其IC50值为9.92mg/L，最大清除率为90.78%；维生素C的IC50值为5.79 mg/L，最大清除率为93.56%。表明余甘子多糖低浓度时清除DPPH·的能力弱于维生素C，而高浓度时清除DPPH·的作用与维生素C相当。

4 结论与讨论

植物多糖具有抑制肿瘤、免疫调节、降血脂、降血糖、抗凝血、抗氧化等多种药理作用[17]。多糖作为余甘子的主要活性成分之一，含量丰富，通过水提醇沉，纯化后所得余甘子多糖为48.94%。研究报道，余甘子提取物可明显改善胰岛素抵抗[18]，余甘子水提物对四氧嘧啶所致小鼠具有显著的降血糖作用[19]，这与其所含多糖有关。碳水化合物如淀粉先经α-淀粉酶水解生成麦芽糖等，后经α-葡萄糖苷酶进一步水解生成葡萄糖，从而促进人体吸收利用，引起餐后血糖升高。本研究通过体外化学模型试验表明，余甘子多糖可有效抑制α-淀粉酶及α-葡萄糖苷酶活性，说明余甘子多糖可能对淀粉酶解到生成葡萄糖过程中都产生了作用，延缓或抑制了葡萄糖的生成，有助缓解餐后血糖峰值[10]。虽然低浓度时，余甘子多糖对两种酶活性抑制作用均弱于阳性对照阿卡波糖，但随着浓度的升高，其抑制活性增强，抑制率均达95%以上，显著高于阿卡波糖，其抑制作用在试验范围内具有良好的量效关系。同时，余甘子多糖对·OH、O2-·和DPPH·具有一定的清除作用，因此还可以减缓糖尿病患者氧化应激，有效预防糖尿病并发症[6，20]。余甘子作为药食兼用植物，急性毒性及长期毒性实验表明无毒副作用[21]，故其作为一种安全、天然的降血糖、抗氧化保健品或药物具有良好的开发前景。