HPLC法快速筛查保健酒中那非药物及质谱确证

（徐州工业职业技术学院，江苏徐州221140）

保健酒是以优质白酒为酒基，配以山药、枸杞子、淫羊霍、黄芪、当归等，采用现代生物工程技术提取其有效活性物质酿制而成，主要用于调节人体生理机能，以保健、养生、健体为目的，满足消费者对美好生活的需求[1-4]。但随着市场经济竞争加剧、保健品促销方式繁多和人们对养生保健的重视，一些不良厂商向保健酒中非法添加化学药物，以达到保健、滋补、壮阳、强身等功效，其中补肾壮阳类保健酒是那非类药物违规添加重灾区，国家食品药品监督管理总局发布《关于51家保健酒、配制酒企业69种产品违法添加行为的通告》（2015年第45号），通告部分保健酒、配制酒生产企业存在违法添加他达那非、伐地那非、西地那非、硫代艾地那非、红地那非等化学物质，并在产品名称、标识、标签上明示或暗示壮阳、性保健等功能[5-7]。而这些那非类药物通常作为临床治疗男性勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）的处方药物，如他达那非、伐地那非和西地那非。若误食那非类药物易引起一定的不良反应，如头痛、消化不良、肌肉疼痛、鼻塞、皮疹和视觉障碍等症状，尤其是心血管疾病和糖尿病患者若长期误食甚至造成突然死亡[8-11]。为此，国家已严禁保健食品中违规添加。

目前那非类药物检测方法有高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[12-14]、高效液相色谱-串联质谱法（high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry，HPLC-MS/MS）[15-17]和高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱法（high performance liquid chromatography-four stage rod time-offlight tandem mass spectrometry，HPLC/Q-TOF MS）[18-20]，其中质谱法由于检出限低、灵敏度高而被广泛用于那非类药物检测，但由于质谱仪价格昂贵、分析成本高、专业操作复杂而难以满足企业批量的检测需要。本文以14种那非类药物为分析对象，试样经乙腈提取后，采用二极管阵列检测器（diode array detector，DAD）测定，建立了高效液相色谱法快速筛查保健酒中14种那非违禁药物的分析方法；采用HPLC-MS/MS法对于可疑那非类药物残留的阳性保健酒进行确证，提高检测结果的准确性，以期规范那非类药物合理使用。

表1 14种那非类药物标准物质信息Table 1 Standard substance information of 14 kinds of nafil drug

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260型高效液相色谱仪：美国Agilent公司；LCMS-8080型液相色谱-串联质谱仪：日本Shimadzu公司；JP-020S型超声波清洗仪：广州洁盟超声波设备有限公司；MG-2200型氮吹仪：日本EYELA公司；MixPlus涡旋混合仪：合肥艾本森科学仪器有限公司；mini plus纯水超纯水一体机、BS-224S型电子天平：德国Sartorious公司。

那非类药物标准物质（西地那非、高西地那非、羟基高西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、红地那非、那红地那非、羟基红地那非、羟基硫代红地那非、伐地那非、伪伐地那非、乙酰伐地那非、他达那非、氨基他达那非）：上海安谱实验科技股份有限公司，纯度均≥98.0%，其它具体信息见表1；甲醇、甲酸、乙腈、乙酸铵：色谱纯，德国Merck公司；其余试剂为分析纯；试验用水为超纯水。

那非类药物标准储备液：分别称取各那非类药物标准物质0.1 g（精确至0.1 mg），用乙腈溶解，并转移至100 mL容量瓶中定容，浓度为1.0 mg/mL。那非类药物混合标准工作液：用乙腈将标准储备液逐级稀释至浓度为 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL 的标准系列混合工作液，临用时现配。

1.2 液相色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse-plus C18（4.6 mm×150 mm，5μm）；柱温：35 ℃；进样量：10 μL；流动相 A：0.1%甲酸水溶液；流动相B：0.1%甲酸乙腈溶液；流速：0.3 mL/min；检测波长：程序可变波长扫描（见表1）；流动相梯度洗脱条件见表2。

表2 流动相洗脱梯度Table 2 Elution gradient of mobile phase

1.3 质谱条件

电离方式：电喷雾正离子模式；检测方式：多反应检测（multiple reaction monitoring，MRM）；雾化气压力：200 kPa；离子喷雾电压：3 500 V；干燥气温度：330℃；干燥气流速：8 L/min；定性离子对、定量离子、碎裂电压和碰撞能量具体见表3。

表3 那非类药物的质谱参数Table 3 Mass spectrometric parameters of nafil drug

1.4 样品前处理

准确称取2 mL试样于10 mL容量瓶中，加入5 mL乙腈，超声30 min，冷却至室温，用乙腈定容至刻度，摇匀，上清液经0.22 μm有机尼龙膜过滤，滤液供上机测定。

1.5 标准曲线绘制

分别取 0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL 那非类药物混合标准工作溶液进行HPLC测定，以混合标准工作溶液的质量浓度为横坐标，以色谱峰的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，并以测得试样色谱峰面积与标准曲线比较进行定量。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

采用高效液相色谱-二极管阵列检测器（DAD）对14种那非类药物标准溶液在190 nm～800 nm范围内进行紫外吸收色谱峰扫描，结合14种那非类药物在不同波长扫描下的色谱峰紫外吸收情况，并为了消除基质干扰，依据出峰时间选择可变波长进行检测，经优化后选择290nm和230nm为检测波长，其中西地那非、伐地那非、伪伐地那非、乙酰伐地那非、他达那非、氨基他达那非的检测波长选择290 nm，高西地那非、羟基高西地那非、那莫西地那非、硫代艾地那非、红地那非、那红地那非、羟基红地那非、羟基硫代红地那非的检测波长选择230 nm（见表1）。以优化的液相色谱条件对14种那非类药物进行HPLC测定，结果表明，14种那非类药物可获得良好的色谱分离效果（见图1）。

2.2 色谱柱的选择

以色谱柱中14种那非类药物的分离度、峰面积、保留时间等为评估参数，研究Diamonsil C18、Agilent XDB C18、Inertsil C18、Symmetry C18、Zorbax Eclipse-plus C18等不同厂家型号的色谱柱对保健酒中14种那非类药物的分离情况。结果显示：在相同色谱分析条件下，采用Zorbax Eclipse-plus C18色谱分析柱时，14种那非类药物色谱峰可有效分离，保留时间适中，且色谱峰峰型对称、峰面积响应值较高（见图1）。故选择Zorbax Eclipse-plus C18作为分析用色谱柱。

2.3 流动相的选择

以Zorbax Eclipse-plus C18作为分析用色谱柱，研究甲醇-甲酸水、乙腈-甲酸水、甲醇-乙酸铵溶液、乙腈-乙酸铵溶液、乙腈-磷酸缓冲液等不同流动相对14种那非类药物洗脱与分离效果。结果显示：当使用0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作为流动相时，经梯度洗脱后，14种那非类药物可实现良好的分离效果，且色谱峰峰型尖锐对称、高响应值（见图1），故选择0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相。

2.4 基质效应

在色谱纯乙腈、空白保健酒中分别加入适量那非类药物混合标准溶液，使其终浓度依次为1.0 μg/mL（低浓度）、25.0 μg/mL（中浓度）、50.0 μg/mL（高浓度）等3种加标浓度试样，按本文所建HPLC法进行测定，采用相对响应值法计算基质效应（Matrix Effect=B/A×100%，A为色谱纯乙腈中被测那非类药物的色谱峰响应值，B为空白保健酒中被测那非类药物的色谱峰响应值）。结果显示：在色谱纯乙腈和空白保健酒两种不同基质试样中，14种被测那非类药物的基质效应在92.0%～103.6%之间，平均值为96.2%，没有显著的基质效应（见表4）。

图1 14种那非类药物标准品高效液相色谱图Fig.1 High performance liquid chromatogram of 14 kinds of nafil drug

表4 基质效应Table 4 Matrix effect %

2.5 质谱确证条件的优化

由于保健酒大多数是一种中药复方的酒剂，中药材配料越多，基质成分越复杂，采用HPLC测定基质复杂的保健酒中那非类药物非法添加可能会出现假阳性检测结果。为了保障本文所建HPLC法测定结果的准确性，采用HPLC-MS/MS法对于可疑那非类药物残留的阳性保健酒进行进一步确证（见图2）。结果显示：在电喷雾正离子模式下，采用蠕动泵将1.0 μg/mL 14种那非类药物混合标准溶液注入质谱检测器中均可获得响应信号较高的[M+H]+准分子离子峰（母离子）；优化碎裂电压和碰撞能量进行碰撞诱导裂解，获得响应信号稳定的碎片离子峰（子离子），14种那非类药物的母离子、定量离子、定性离子具体见表3。

2.6 线性关系和检出限

取基质相同的空白保健酒试样，依次加入适量那非类药物混合标准工作液使其质量浓度分别为0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 μg/mL，按照本文所建 HPLC 法进行测定，绘制标准曲线。结果表明：14种那非类药物在0.5 μg/mL～50.0 μg/mL范围内，那非类药物质量浓度（x）与其色谱峰峰面积（y）呈现良好的线性关系，相关系数 r2在 0.999 1～0.999 9之间（见表5）。

在空白试样中添加一系列低浓度的那非类药物混合标准工作液，以信噪比S/N=3计算方法检出限（limit of detection，LOD），以信噪比S/N=10计算方法定量限（limit of quantitation，LOQ）。结果表明：LOD 在0.06 μg/mL～0.24 μg/mL 之 间，LOQ 在 0.20 μg/mL ～0.80μg/mL之间（见表5）。

2.7 回收率和精密度

在空白保健酒中分别加入适量那非类药物混标，使其终浓度依次为 1.0 μg/mL（低浓度）、50.0 μg/mL（中浓度）、100.0μg/mL（高浓度）等 3种加标水平，按照本文所建HPLC法进行回收率和精密度试验（表6）。从表6中可知：在加标浓度5.0mg/kg～50.0mg/kg范围内，保健酒种14种那非类药物平均加标回收率为94.1%～101.4%，相对标准偏差（RSD）为1.1%～3.7%。

图2 14种那非类药物总离子流色谱图Fig.2 Total ion chromatograms of 14 kinds of nafil drug

表5 线性方程、相关系数、检出限和定量限Table 5 Linear equations，correlation coefficients，detection limits and quantitation limits

2.8 实际样品的检测

随机选购市售10份保健酒，按照本文所建HPLC法进行14种那非类药物非法添加快速筛查种类及其含量。结果显示：10份保健酒中检出那非类药物阳性试样3份，阳性检出率为30%；西地那非、他达那非检出率最高，其中西地那非添加量最高达218.3 mg/mL（见表7），这可能是由于西地那非是当前市场上流行的治疗勃起功能障碍的口服速效处方药，且价格低廉，质量有保证，故被不良厂商非法添加到保健酒种，以达到速效、高效的保健、滋补、壮阳、强身等功能宣称广告目的，从而进一步拓展销路而非法牟利。

表7 实际样品的检测Table 7 Detection of actual samples

续表7 实际样品的检测Continue table 7 Detection of actual samples

3 结论

保健酒中的非法添加问题亟待解决，而保健酒的检测分析是保证和提高品质的首要任务。本研究以14种那非类药物为分析对象，试样经乙腈提取后，采用二极管阵列检测器（DAD）测定，建立了高效液相色谱法快速筛查保健酒中14种那非违禁药物的分析方法；采用HPLC-MS/MS法对于可疑那非类药物残留的阳性保健酒进行进一步确证。结果表明：在0.5 μg/mL～50.0 μg/mL范围内，14种那非类药物质量浓度与其峰面积呈现良好的线性关系，相关系数r2在0.999 1～0.999 9 之间；LOD 在 0.06 μg/mL～0.24 μg/mL，LOQ 在0.20μg/mL～0.80μg/mL；平均回收率在94.1%～101.4%，RSD在1.1%～3.7%。该HPLC法测定保健酒中14种那非类药物具有操作简单、回收率高、精密度好、检出限低等优点，可为保健酒中那非类药物非法添加监督管理提供检测技术，有效规范保健酒行业健康发展。