聚赖氨酸抑制冷藏鱼糜制品优势菌及品质影响

李唐飞，范大明，4，黄建联，赵建新，4，*，闫博文，周文果，张文海，张灏，4

（1.江南大学食品科学与技术国家重点实验室，江苏无锡214122；2.江南大学国家功能食品工程技术研究中心，江苏无锡214122；3.江南大学食品学院，江苏无锡214122；4.江苏省食品安全与质量协同创新中心，江苏无锡214122；5.福建安井食品股份有限公司，福建厦门361022）

国内鱼糜市场消费持续增长，消费者对鱼糜产量和产品种类需求日益增加。传统鱼糜制品使用冷冻鱼糜为原料，且产品贮藏常常采用低温冷冻。这种长时间的冷冻贮藏出现蛋白质冷冻变性以及油脂氧化现象，致使鱼糜制品的风味和品质下降[1]。采用冷藏的方式贮藏新鲜鱼糜制品，能一定程度上减少鱼糜制品品质的劣化。但是，由于鱼糜制品是一种营养丰富的高水分产品，因此极易受到腐败微生物的污染，贮藏期间微生物代谢繁殖会导致鱼糜制品品质的降低以及营养的流失[2]。在生产过程常常使用高温处理等方式降低微生物对鱼糜制品带来的损失，但这些传统的处理方式不仅会破坏鱼糜制品的风味和口感，且需要较高能耗[3]。因此选择一种适合的杀菌抑菌处理方式是保证鱼糜制品品质风味，延长产品货架期的重要环节。

ε-聚赖氨酸（ε-L-polylysine，ε-PL）是一种由微生物分泌的天然广谱性抑菌物质，具有α螺旋结构，主要由ε-氨基和α-羧基连接形成的具有多肽结构的生物碱[4]。ε-PL分子量一般为 2.5 kDa～4.5 kDa，较低聚合度的ε-聚赖氨酸呈现白色，高聚合度ε-聚赖氨酸呈现淡黄色且略带苦味，有良好的水溶性。ε-聚赖氨酸具有较强的热稳定性，在121℃下高压处理也不会发生分解，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌都有良好的抑菌效果。聚合度小于10的ε-聚赖氨酸不具有抑菌效果，高聚合度抑菌效果良好[5]。聚赖氨酸因其具有较好的抑菌效果、安全无毒，稳定性强等优点，被广泛应用于蛋类制品、米类制品等高蛋白食品中[6]。目前，聚赖氨酸已实现工业化生产，在如美国、日本、韩国等国家，聚赖氨酸均已被用作食品防腐剂，并已被广泛使用[7]。

本研究以新鲜鱼糜制品为研究对象，探究新鲜鱼糜制品冷藏过程中菌相的变化，以及聚赖氨酸对贮藏期间优势菌群的抑菌效果，以及对新鲜鱼糜制品品质的影响，从而确定聚赖氨酸应用于鱼糜制品中的最佳添加剂量。为今后即食鱼糜制品生产和贮藏提供一种保证鱼糜制品品质的抑菌方式，有助于鱼糜产业产品进一步发展。

1 材料与方法

1.1 材料于试剂

新鲜白鲢鱼：无锡农贸市场；食盐：无锡华润万家超市；聚乙烯肠衣：福建安井食品有限公司提供；聚赖氨酸：强耀生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

MO－385型莫菲绞肉机：佛山桃花岛电器有限公司；HLQ-10型斩拌机：上海申发机械有限公司；MP-15型双槽恒温水浴锅：南京先欧仪器制造公司；SZ200手摇式灌肠机：南京威利朗食品机械有限公司；SU504手动式U型封口机：河北衡水鸿昊企业有限责任公司；TA.XTPlus物性分析仪：英国Stable Micro System公司；Hiseq PE 250：美国Illumina公司。

1.3 方法

1.3.1 新鲜鱼糜的制作

将购置的新鲜白鲢鱼去头、鱼皮、鱼鳞以及内脏后，手工采集鱼肉，采集过程中，剔除不需要的红肉部分。用绞肉机将鱼肉绞碎并筛去鱼骨。用5倍鱼肉质量体积的5℃以下的自来水将所采鱼肉漂洗2次，再用含0.3%的NaCl的5℃以下的自来水漂洗1次，每次漂洗5 min，静置3 min后倾去水及表面杂质。用纱布挤压脱水至水分为80%～85%为止。

1.3.2 鱼糜前处理

将600g鱼糜放入斩拌机中，斩拌速度为2600 r/min，在4℃左右的低温下进行低速空斩2 min，空斩过程中每30秒停止斩拌10 s，直至鱼糜抱团黏壁且无硬颗粒。称取鱼糜质量3%的食用盐，均匀加入到鱼糜中，4℃～10℃下盐斩2 min至鱼糜浆料呈现具有一定黏度的均匀浆状。将ε-聚赖氨酸与少量水混合均匀，加入到鱼糜鱼浆中，在4℃～10℃下进行料斩。料斩时间为2 min，每30秒停止斩拌10 s。

1.3.3 鱼肠的制作

使用斩拌完成的鱼糜浆用灌肠机灌入直径为2.5cm的聚乙烯肠衣中，将两端使用封口机进行密封，放置于水浴锅中进行二段式的水浴凝胶熟化，具体水浴条件为一段40℃水煮30 min，二段水浴条件为90℃水煮20 min[8]。熟化完成立即放入冰水里降温。

1.3.4 低温冷藏

将凝胶熟化冷却后的鱼肠进行分批贮藏，贮藏条件为4℃恒温冷藏。

1.3.5 基因组测序

参考Tarnecki等[9]的方法，FastDNA SPIN Kit for Soil DNA提取试剂盒提取DNA，具体操作参考试剂盒说明书。提取DNA后，对DNA进行PCR扩增和产物纯化，PCR引物为341F和806R，扩增片段长度465bp，PCR 条件具体为95℃，5 min→（95℃，30 s；52℃，30 s；72℃，30 s）30个循环→72℃，7 min→12℃∞。PCR完成后对PCR产物胶进行回收，测量DNA浓度后上机测序。

1.3.6 最小抑菌浓度

参考Gunes等[10]，将纯化后菌悬液用生理盐水进行重悬，3 000 r/min离心3 min，重复两遍。用液体培养基配置相应浓度的聚赖氨酸，采用二倍梯度法配制聚赖氨酸溶液。用聚赖氨酸溶液重悬，置于37℃摇床培养12 h后，取200 μL至96孔板，用酶标仪测量OD600。每样品取3个平行。以空白液体培养基为阴性对照组，以抗生素为阳性对照组。

1.3.7 凝胶强度

将冷藏中的鱼肠取出，剥去外部肠衣后切块成25 mm圆柱体，保证圆柱体上下地面均匀。将圆柱体鱼肠置于室温，待其温度上升至室温后，用TA.XTPlus物性分析仪测定鱼肠凝胶强度，采用球形探头P/5S。具体测定参数为测定速度1.00 mm/s，测量下压距离15 mm[11]。每组测量6个平行样，取结果平均值，凝胶强度具体计算方法。

凝胶强度/（g·cm）=破断强度（g）×破断距离（cm）

1.3.8 持水性

取出冷藏的鱼肠样品，剥去鱼肠外的肠衣部分，将鱼肠切成质量为2 g左右的薄片。将薄片平铺至称量纸，称量纸厚度为5层。采用冷冻离心机在4℃下8000r/min离心20min。离心完成后称取鱼肠片质量[12]。每组3个平行，结果取平均值，计算方法。

式中：Xw为持水性，%；W1为初始样品质量，g；W2为离心后的样品质量，g。

1.3.9 色泽

将冷藏鱼肠切片，使用校准后的高精度分光测色仪进行测量，分别测量鱼肠的亮度L*，红色度a*，以及黄色度b*，每组重复6次平行，取6组平行的平均值[13]。计算方法如下。

1.3.10 菌落总数

采用平板菌落计数法，具体参考国标GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》。在营养琼脂培养基上进行涂布、计数。取10 g冷藏鱼糜样品，样品分别取鱼肠两端和中间等量，加入9倍体积的生理盐水，用拍打式均质机均质。采用梯度稀释法对样品进行稀释至在平板上菌落数在30个～300个范围内便于计数。计数取3个数量级，每个数量级取3组平行[14]。吸取250 μL至平板涂布，将平板倒置于37℃恒温培养箱中培养24 h～48 h，取出计数。

1.3.11 数据分析

试验数据和图形处理分析采用Excel和Origin 9.0软件，试验数据差异性分析采用SPSS 17.0软件中的Duncan法评价。

2 结果与讨论

2.1 新鲜鱼糜制品中微生物菌相分析

对冷藏期间的鱼糜制品进行菌相分析，分析在贮藏期12 d内，鱼糜制品菌相变化。试验采用宏基因组测序对鱼糜制品进行分析。具体测序结果如图1所示。

图1 鱼糜制品冷藏过程中不同科微生物占比Fig.1 The proportion of different microbes in the cold storage of surimi products

通过宏基因组对鱼糜制品中微生物进行菌属鉴定，结果显示，在鱼糜制品中主要存在的微生物为希瓦氏菌（Shewanellaceae），气单胞菌（Aeromonadaceae），芽孢杆菌（Bacillaceae），莫拉菌（Moraxellaceae）和假单胞菌（Pseudomonadaceae）。腐败希瓦氏菌是低温贮藏鱼类制品的腐败微生物之一，会产生难闻的气味，在较高温度下即可抑制或杀死腐败希瓦氏菌[15]。鱼糜制品普遍采用二段式加热方式进行凝胶熟化，温度最高可达90℃～100℃，且持续时间较长，因此经熟化的鱼糜制品中腐败希瓦氏菌较少，图1中腐败希瓦氏菌含量基本稳定在2%～3%，数量较少，在贮藏后期出现明显增加。气单胞菌是淡水养殖中细菌性出血病的重要病原体之一，广泛存在于河流、海水等水生环境中[16]。气单胞菌最适生长范围为30℃，但在0℃～40℃均可生长。图1中，气单胞菌在贮藏前期所占比重基本不变但是在贮藏后期，气单胞菌的比重明显增加，说明鱼糜制品在熟化处理过后部分气单胞菌被杀死，但仍然有气单胞菌存活。莫拉菌是一种呈现杆状或者球状的革兰氏阴性菌，最适生长温度为33℃～35℃[17]。图1中，莫拉菌在冷藏过程中所占比例明显呈现下降趋势，表明在经过高温熟化后，且在4℃冷藏条件下，莫拉菌被杀死或受到抑制。

假单胞菌属革兰氏阴性杆菌，不形成芽孢，对有机物质如蛋白质有极强的分解能力，并以此为能量来源。因此，假单胞菌常见于鱼类等高蛋白制品中，且为优势腐败菌群[18]。如图1所示，在鱼糜凝胶制品中，假单胞菌为优势菌群，菌数量占比36%。但是在冷藏过程中，假单胞菌的比例急剧下降，在贮藏后期已不再是优势菌群。假单胞菌是一种不产生芽孢的非耐热菌种，因而在经过高温蒸煮后，假单胞菌活菌数量急剧下降。

芽孢杆菌是一种能够形成芽孢的杆菌或球菌，对外界因子抵抗性较强，耐高温能在较高温度下存活。芽孢杆菌在食品中能产生毒素，从而造成腹泻、呕吐等不良症状[19]。芽孢杆菌有一定的抑菌作用，能产生有抑菌效果的产物。由于芽孢的存在，高温蒸煮并不能杀死鱼糜制品中的芽孢菌，且在冷藏过程中，芽孢菌仍然缓慢的生长。图1中可以明显看出在冷藏贮藏期间，芽孢杆菌的比重大幅上升，在贮藏期中后期就成为优势菌群。表1为鱼糜制品中优势菌群在冷藏过程中的数量占比。在冷藏的12天内，贮藏前期假单胞菌和莫拉菌所占比重较多，但是在贮藏中后期，芽孢菌比重明显上升，贮藏期间芽孢菌比重增加120%。假单胞和莫拉菌在贮藏前期虽然比重较大，但多数为死菌，活菌数量较少。芽孢菌在贮藏前期活菌数量较多，因此冷藏过程中持续生长成为优势菌种，且芽孢杆菌具有一定的抑菌作用，抑制了其他菌群的生长。

表1 冷藏期间鱼糜制品中优势菌占比Table 1 The proportion of dominant bacteria in surimi products during cold storage %

2.2 聚赖氨酸的抑菌效果

新鲜鱼糜制品在冷藏过程中，微生物构成发生了变化。主要优势菌从贮藏前期的假单胞菌到后期的芽孢菌。假单胞菌是在鱼糜制品中常见的腐败菌，具有极强的分解蛋白质能力，因此会导致鱼糜制品在冷藏过程中的蛋白质降解，从而影响鱼糜制品品质和风味[20]。大肠杆菌属肠杆菌科、埃希氏菌属，革兰氏阴性菌[21]。大肠杆菌是一种病原菌，各国家对食品中大肠杆菌数量都有严格的数量控制，由于大肠杆菌分布广，生存能力强，所以在工业生产中食品产品易受到大肠杆菌的污染。聚赖氨酸是一种具有广谱抑菌效果的抑菌剂，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及真菌都具有较强的抑菌能力。

表2为聚赖氨酸对鱼糜制品中分离纯化出的假单胞菌和芽孢杆菌以及工业生产中要严格控制的大肠杆菌的最小抑菌浓度。

表2 聚赖氨酸对优势菌及大肠杆菌的最小抑菌浓度Table 2 MIC of poly-lysine to dominant bacteria and Escherichia coli

由表2可知，聚赖氨酸对大肠杆菌、假单胞菌以及芽孢菌均具有良好的抑菌效果。其中对大肠杆菌抑菌效果最佳，最小抑菌浓度为30 μg/mL。对革兰氏阳性菌的芽孢杆菌也有一定的抑菌效果，最小抑菌浓度为60 μg/mL。因此，向鱼糜制品中加入一定量的聚赖氨酸能有效的抑制鱼糜制品中优势菌和腐败菌的生长。

2.3 聚赖氨酸对鱼糜制品的抑菌效果

低温冷藏鱼糜制品，微生物的污染与代谢是导致鱼糜凝胶劣化的主要因素之一。同时菌落总数是食品品质指标之一，关乎到食品安全以及食品货架期。试验添加不同剂量的聚赖氨酸，4℃冷藏12 d测得鱼糜制品中菌落总数具体试验结果如图2所示。

图2 不同聚赖氨酸添加量在冷藏过程中鱼糜制品的菌落总数Fig.2 Total number of colonies of surimi products with different contents of poly-lysine during cold storage

图2中，与空白对照组相比，添加聚赖氨酸能明显抑制鱼糜制品在冷藏期间微生物的数量，且聚赖氨酸添加量越高，对微生物抑制效果越显著。鱼糜制品中，微生物菌相构成在冷藏过程中有变化，主要优势菌也发生改变，但是由于聚赖氨酸具有广谱的抑菌效果，对鱼糜制品贮藏前后期的优势菌假单胞菌和芽孢菌均有良好的抑菌效果，因此聚赖氨酸能够有效的抑制鱼糜制品冷藏过程中微生物的生长，降低由于微生物导致的品质劣化。

2.4 多聚赖氨酸对鱼糜制品凝胶强度的影响

鱼糜制品相对于其他肉糜类产品，具有更高的凝胶强度，因此凝胶强度是衡量鱼糜制品品质的重要指标，能够表征鱼糜制品在咀嚼时的口感。鱼糜制品是一种高蛋白产品，凝胶强度主要来自于蛋白质的凝胶性。在高温蒸煮过程中蛋白质出现热变形，形成有序的网状结构从而使得鱼糜产品具有较高的凝胶强度。凝胶强度越高说明鱼糜制品品质越高[22]。试验向鱼糜制品中加入不同添加量的聚赖氨酸，不同聚赖氨酸添加量对凝胶强度的影响见图3。

由图3可知，向鱼糜制品中加入聚赖氨酸能够小幅提升鱼糜凝胶制品的凝胶强度，但显著性分析表明不同聚赖氨酸添加量的鱼糜制品凝胶强度差异不显著。说明，聚赖氨酸鱼糜凝胶制品不能明显提升产品凝胶强度，不会对凝胶制品品质造成损害。

2.5 多聚赖氨酸对鱼糜制品持水性和白度的影响

鱼糜凝胶制品的持水性是指鱼糜制品将水分保留其微观结构中的能力，鱼糜凝胶制品凝胶网络越致密，离心后水分越不易流失，凝胶品质越好，是鱼糜制品品质的重要衡量指标。试验鱼糜制品中加入不同添加量的聚赖氨酸，测量鱼糜制品的持水性以及白度。不同聚赖氨酸添加量对鱼糜制品持水性和白度的影响见图4和图5。

图3 不同聚赖氨酸添加量的鱼糜制品的凝胶强度Fig.3 Gel strength of surimi products with different contents of poly-lysine

图4 不同聚赖氨酸添加量的鱼糜制品的持水性Fig.4 Water holding property of surimi products with different contents of poly-lysine

图5 不同聚赖氨酸添加量的鱼糜制品的白度Fig.5 Whiteness of surimi products with different contents of poly-lysine

试验表明，不同聚赖氨酸添加量的鱼肠样品持水性差异较小，但高浓度的聚赖氨酸会降低鱼糜制品持水性。

由图5表明，由于聚赖氨酸具有本身是一种淡黄色粉末，因此高添加量的聚赖氨酸会降低鱼糜制品的白度，低添加量不影响鱼糜制品白度。

3 结论

本试验通过宏基因组学，研究鱼糜制品在冷藏过程中微生物的菌相变化，比较冷藏前后期优势菌的变化。通过添加聚赖氨酸，抑制鱼糜制品冷藏过程中的优势菌生长，从而降低由于微生物导致的品质劣化。结果表明：鱼糜制品在冷藏过程中优势菌由前期的假单胞菌到贮藏后期的芽孢菌，且多数非耐热腐败菌经由高温蒸煮杀菌。聚赖氨酸对鱼糜制品冷藏过程中的两种优势菌有明显的抑菌效果，聚赖氨酸不会对鱼糜制品品质造成明显的不利影响，且最佳的聚赖氨酸添加量为0.1%。综上所述，聚赖氨酸是一种能有效降低鱼糜制品在冷藏过程中的品质劣化，适合在鱼糜制品工业化生产中推广使用。