响应面法优化云南宣木瓜齐墩果酸和熊果酸的提取工艺研究

罗小芳，郭乙颖，胡柳，王钗，宋艳芝，李治章，2，王宗成，*

（1.湖南科技学院化学与生物工程学院，湖南永州425199；2.湖南科技学院湖南省银杏工程技术研究中心，湖南永州425199；3.湖南科技学院湘南优势植物资源综合利用湖南省重点实验室，湖南永州425199）

宣木瓜是蔷薇科木瓜属植物，是集药用食用的植物，主要产于安徽，四川，云南，湖北等地，种植面积广泛，木瓜色香味俱佳，有“岭南果王”之称。药典记载：宣木瓜性温、味酸涩，有舒筋活络、祛风湿痹等症[1-2]。木瓜中含有多种氨基酸和营养物质，而且还含有多种活性物质，如齐敦果酸、熊果酸具有抗癌、提高免疫力降血脂、降血糖的功效[3]。我国目前宣木瓜用量不大，大多宣木瓜腐烂丢弃，造成不小的浪费，因此从木瓜中提取齐敦果酸和熊果酸对于开发木瓜的药用价值，以及其副产物的综合利用有重要的意义。

齐墩果酸和熊果酸是互为同分异构体的两种五环三萜类脂溶性化合物[4]，目前齐墩果酸与熊果酸的提取方法主要有回流提取法、超声辅助法和微波辅助提取法等[5]。超声波提取技术属新兴的生物提取技术，工作原理是利用超声波的机械效应，空化效应和热效应，通过增大介质分子的运动速度、介质的穿透力提取生物有效成分，具有操作简便、提取效率高、有效成分不被破坏等优点[6-9]。本试验研究以超声波辅助快速提取宣木瓜中的齐墩果酸和熊果酸，根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理[10-12]，用响应面分析法对提取工艺进行优化，旨在为工业化提取齐墩果酸和熊果酸提供理论依据。

1 仪器与材料

FV-SV-360超声细胞破碎仪：宁波新芝仪器有限公司；LC-20AT高效液相色谱仪：日本岛津；JFSD-100粉碎机：江阴市丰华药化机械有限公司；YP1200分析天平：奥豪斯国际贸易（上海）有限公司；WG-71新型电热恒温鼓风干燥箱：天津市泰斯特仪器有限公司。

宣木瓜：采买自云南大理，清洗干净，去籽切片，并放在恒温干燥箱中干燥，干燥后粉碎过40目筛；齐墩果酸标准品、熊果酸标准品：上海源叶生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：德国默克；无水乙醇、乙酸铵（均为分析纯）：天津市福晨化学试剂厂。

2 方法

2.1 齐墩果酸和熊果酸的提取工艺

宣木瓜→干燥→粉碎→过筛40目→精密称取干燥、粉碎、过筛的宣木瓜→置于烧杯内→按单因素控制试验条件→称重→置于超声波细胞粉碎仪中提取→补失重→过微滤膜→取续滤液→供试品溶液→按药典方法进行检测

2.2 高效液相色谱分析方法[13]

2.2.1 齐墩果酸和熊果酸含量测定的液相条件

色谱柱：岛津 C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流动相：乙腈-10 mmol/L乙酸铵水溶液（80∶20，体积比）；流速：0.8 mL/min；柱温：18℃；检测波长：210 nm。

2.2.2 标准曲线的制作

2.2.2.1 齐墩果酸的标准曲线的制作

准确称取齐墩果酸标准品11.0 mg，用甲醇溶液溶解，并定容至 10 mL。分别精密吸取 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，分别进样 10 μL。以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，得到线性回归方程。

2.2.2.2 熊果酸的标准曲线的制作

准确称取熊果酸标准品10.9 mg，用甲醇溶液溶解，并定容至 10 mL。分别精密吸取 1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL至10 mL容量瓶中，用甲醇溶液稀释至刻度，分别进样 10 μL。以进样量（μg）为横坐标，峰面积积分值（y）为纵坐标绘制标准曲线，并进行线性回归，得到线性回归方程。

3 结果与讨论

3.1 齐墩果酸和熊果酸的标准曲线

以齐墩果酸和熊果酸的质量（μg）为横坐标，色谱峰面积（mAU·s）为纵座标，绘制标准曲线（图1～图2），并进行线性回归，得到线性回归方程。

齐墩果酸 y=493 101x+2 553.4（R2=0.999 9），表明齐墩果酸在0.06 μg～0.39 μg范围内线性关系良好。熊果酸 y=569 380x-4 920（R2=0.999 8），结果表明，熊果酸在 0.11 μg～0.76 μg范围内线性关系良好。

图1 齐墩果酸标准曲线Fig.1 Standard curve of oleanolic acid

图2 熊果酸标准曲线Fig.2 Standard curve of ursolic acid

图3 乙醇浓度、液料比、超声功率及超声时间对齐墩果酸和熊果酸提取效果的影响Fig.3 Effect of ethanol concentration，liquid-to-solid ratio，ultrasonic power and ultrasonic time on the yield of oleanolic acid and ursolic acid

3.2 单因素试验及结果

乙醇浓度、液料比、超声功率及超声时间对齐墩果酸和熊果酸提取效果的影响见图3。

3.2.1 乙醇浓度对提取效果的影响

固定超声破碎提取时间 3 min，液料比 20∶1（mL/g）与超声功率480 W，考察不同乙醇浓度对齐墩果酸与熊果酸提取得率的影响（见图3A）。由图3A可知，乙醇浓度为60%～90%时，齐墩果酸与熊果酸的提取得率都随乙醇浓度的提高而增加。乙醇浓度为90%时，二者的提取得率最高，继续增加乙醇浓度，其提取得率几乎没有变化。齐墩果酸与熊果酸均溶于乙醇，不溶于水，两者随乙醇浓度的提高，溶解度相应增大，提取得率也随之提高[8]。因此，中心组合试验选取乙醇的体积分数范围为80%～100%。

3.2.2 液料比对提取效果的影响

固定乙醇体积分数90%，超声提取时间3 min与超声功率480 W，考察不同液料比对齐墩果酸与熊果酸提取得率的影响（见图3B）。图3B可以看出，当液料比从 10∶1（mL/g）增加至 20∶1（mL/g）时，齐墩果酸与熊果酸提得率均相应的提高，继续增加液料比，齐墩果酸与熊果酸提取得率变化不明显。增大液料比可以提高有效成分的扩散速度，有助于齐墩果酸与熊果酸从基质中溶出，考虑到提取液浓缩所需的能耗，中心组合试验选择液料比为 20∶1（mL/g）。

3.2.3 超声功率对提取效果的影响

固定乙醇体积分数 90%，液料比 20∶1（mL/g）与超声提取时间3 min，考察不同超声功率对齐墩果酸与熊果酸提取得率的影响（见图3C）。图3C可以看出，当超声功率从240 W增加至480 W时，齐墩果酸与熊果酸提得率均相应的提高，继续增加超声功率，齐墩果酸与熊果酸提取得率反而有所下降。增大超声功率可以提高植物细胞的破碎度，有助于齐墩果酸与熊果酸从基质中溶出，但超声功率过高会破坏齐墩果酸与熊果酸的结构，降低提取得率。因此中心组合试验选择超声功率的范围为360 W～600 W。

3.2.4 超声时间对提取率的影响

固定乙醇浓度 90%，液料比 20∶1（mL/g）与超声功率480 W，考察不同超声提取时间对齐墩果酸与熊果酸提得率的影响（见图3D）。由图3D可知，随着超声提取时间的延长，空化效应产生大量的新生表面，提取液的温度升高，加速了有效成分的溶解与扩散，提取得率逐渐提高；当时间达到3 min时，齐墩果酸与熊果酸的提取得率均为最高，说明此时已达到提取平衡[12]。此后再延长时间，齐墩果酸与熊果酸的提取得率变化不明显。因此，中心组合试验选择提取时间的范围为 2 min～3 min。

3.3 响应面分析试验及结果

3.31 响应面分析试验设计

综合单因素试验结果，液料比对齐墩果酸与熊果酸的提取得率影响较小，因此固定液料比为20∶1（mL/g），然后根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理，选取乙醇浓度、超声功率、超声时间3个因素为自变量，齐墩果酸和熊果酸相加的总得率为响应值，设计三因素三水平的二次回归方程来拟合自变量与总得率之间的函数关系，采用响应面分析方法优化提取工艺。各因素水平及编码见表1。

表1 响应面分析因素与水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

3.3.2 响应面试验结果分析

以 A（乙醇浓度）、B（超声功率）、C（超声时间）为自变量，以齐墩果酸和熊果酸的总得率为响应值（Y），进行响应面分析试验，试验结果见表2，并利用软件对结果进行回归分析，结果见表3。

表2 响应面试验设计方案及结果Table 2 Response surface design arrangement and experimental results

表3 响应面设计回归方程的方差分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

表2中共有17个试验组合，1～12为分析因试验，13～17为零点试验。采用Design Expert8.0.6软件对试验数据进行分析，由此可求出影响因素的一次项、二次项及其交互项的关联方程为：齐墩果酸和熊果酸的总得率=3.85＋0.27A＋0.11B＋0.35C－0.10AB－0.21AC－0.13BC－0.16A2－0.043B2－0.15C2。

对回归方程进行方差分析，结果见由表3，可知超声时间、超声功率、乙醇浓度3个因素对齐墩果酸和熊果酸提取总得率的影响顺序为：超声时间＞乙醇浓度＞超声功率。且3个因素对齐墩果酸和熊果酸提取总得率影响极显著；超声时间和乙醇浓度二次项对齐墩果酸和熊果酸提取总得率的影响均达到极显著水平；交互项对得率的影响均达到显著水平。模型回归P值＜0.000 1差异极显著，失拟项P值=0.183 8>0.05，又有模拟决定系数R2=0.991 6，说明该模型齐墩果酸和熊果酸总得率的变化99.16%来自所选因变量，且与实际情况拟合很好，能够正确反应齐墩果酸和熊果酸得率与超声时间、乙醇浓度及超声功率之间的关系。因此，可用该模型对齐墩果酸和熊果酸的最佳试验工艺进行分析和预测。

3.2.4 响应面曲面分析

响应面图是响应值Y与对应的试验因素A、B、C构成的三维空间的曲面图及其在二维平面上的等高图，将一个因素固定在零水平，对另外两个因素进行分析，从中可以直观地反映各因素及其交互作用对响应值的影响，利用Design Expert软件作出响应曲面及等高线图。各因素交互作用响应面和等高线图如图4。

图4比较可知，超声时间对齐墩果酸和熊果酸提取的总得率的影响曲线相对较陡，影响最为显著；其次是乙醇浓度，而超声功率对齐墩果酸和熊果酸提取的总得率的影响曲线相对平滑，影响较小。

由软件分析可得，提取齐墩果酸和熊果酸的最优工艺条件为：乙醇浓度95.56%，超声时间3.79 min、超声功率440 W，在此条件下，齐墩果酸和熊果酸的理论得率为4.05 mg/g。

图4 各提取因素之间的交互作用影响Fig.4 Response surface plots showing the mutual effects of different factors on the yield of total yield of oleanolic acid and ursolic acid

3.4 验证试验

为了检验试验结果与真实情况是否一致，根据上述分析结果进行验证试验，考虑到实际操作情况，确定提取齐墩果酸和熊果酸的最优工艺条件为：乙醇浓度95%，超声时间3.8 min、超声功率440 W，在此条件下进行6次平行试验，齐墩果酸和熊果酸提取的总得率4.03 mg/g；与理论预测值接近。因此，响应面法优化所得的超声辅助提取条件参数准确可靠，具有一定的实用价值。

4 结论

采用超声辅助提取宣木瓜中的齐墩果酸和熊果酸，通过单因素试验和Box-Behnken试验设计及响应面分析对提取齐墩果酸和熊果酸的工艺进行优化，得到齐墩果酸和熊果酸的最佳工艺条件为：乙醇浓度95%，超声时间3.8 min、超声功率440 W，测得的齐墩果酸和熊果酸的实际总得率为4.03 mg/g，与理论基本相符。