青浦地区生菜腐烂病原分离鉴定及致病性测定

刘彬，王桂英，陆鋆赟

(上海市青浦区蔬菜技术推广站，上海 青浦 201799)

生菜(LactucasativaL.)，又名叶用莴苣，是世界范围内广泛种植的绿叶蔬菜之一[1]。上海为我国生菜生产和消费最多的地区之一，2016年种植面积在6 300 hm2左右，近年来上海青浦地区生菜种植面积一直维持在1 250 hm2。在种植过程中，生菜茎基部腐烂情况发生较重，发病后期茎基部分离。春秋冬三季均有发生，尤以春季发病最重，其发病症状与软腐病等不易区分。为此由请重庆市农业科学院茶叶研究所对青浦地区生菜腐烂病害，进行病原菌分离、致病性测定、形态学鉴定和分子鉴定，以明确青浦地区生菜腐烂的病原，为病原诊断和后期防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

于2016年12月在青浦区重固镇上海春昌蔬果专业合作社设施大棚地采集具有典型腐烂症状的生菜病株，并收集种植品种种子回实验室育苗作为阴性对照。

1.2 病原菌分离培养

参照文献[2]。取典型带病株，无菌刀片切取病健交界处小块组织，用1% NaOCl表面消毒5 min，灭菌水冲洗3次，分别置于马铃薯葡萄糖琼脂培养基和牛肉膏蛋白胨培养基中，每皿3～5块，置25 ℃恒温箱中培养观察。同时将生菜种子按相同方法处理后观察培养情况。菌丝萌发后，选典型菌落转入新皿继续培养、纯化、保存。

1.3 致病性测定

采用注射法接种分生孢子，用注射器向健康生菜叶片和生菜茎基部注入含有分生孢子的悬浮液(浓度为1.0×106个·mL-1)10 μL，用无菌纱布覆盖保湿，接种6株，并用无菌水做对照。接种后在气候箱内保持相对湿度90%以上，12 h光照+12 h黑暗25 ℃培养。

1.4 病原菌的形态学鉴定

在解剖镜和显微镜下观察病原菌形态并测量大小。按文献标准进行形态鉴定[3]。

1.5 病菌ITS序列比较

1.5.1 菌丝体的培养与收集

选取典型菌株SCJH-1601进行分子检测。将斜面保存的菌株接种在PDA培养基上进行活化。将活化后的菌株接种到液体PDA培养基，每皿均匀接种2个菌丝块，每个试管接种2～3个，于25 ℃培养5 d后，用灭菌接种针挑取菌丝，置于4 ℃保存备用。

1.5.2 基因组DNA 的提取

基因组DNA的提取和纯化采用试剂盒方法。

1.5.3 ITS扩增

用真核生物核糖体DNA通用引物ITS1和ITS4进行PCR扩增[4]。其序列为ITS1：5′-CCGTAGGT GAACCTGCGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGAT ATGC-3′。

1.5.4 PCR反应条件

PCR反应体系总体积为25 μL，反应液组分为：10×PCR Buffer 2.5 μL，25 mmol Mg Cl22 μL，10 mmol dNTP 1 μL，5 U·μL-1Taq酶0.15 μL，模板DNA 2 μL，引物ITS1和ITS4(25 μmol·L-1)各0.5 μL，dd H2O 16.35 μL，在PTC-100 PCR扩增仪上扩增。

扩增条件。95 ℃预变性4 min；94 ℃变性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸 1 min，共35个循环；最后72 ℃延伸10 min。PCR产物委托上海生工生物工程有限公司进行纯化和测序[5]。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离培养结果

通过马铃薯葡萄糖琼脂培养基分离培养，仅发现1种菌丝，经转管培养后，发现该真菌4 d就可在培养基上产生肉眼可见的菌核。该病菌经显微镜观察，菌核相对较小，似油菜籽状，大小0.4～1 mm，子囊孢子椭圆形，大小(12～16)μm×(6～8)μm。通过牛肉膏蛋白胨培养基分离，未发现有细菌侵染。

2.2 致病性测定结果

通过注射法接种分生孢子后，健康生菜茎基部在第3天产生腐烂，并有白色菌丝附着(图1)，清水对照无任何症状；到第7天时，生菜茎基部产生0.5 mm大小的黑色菌核(图2)，生菜已基本腐烂，轻轻一提就可与根部分离。对第3天和第7天的接种生菜采用1.2方法进行分离，得到1种病菌，培养和镜检结果与2.1结果一致，所以该病菌为青浦地区生菜腐烂的致病菌。

图1 致病性测定第3天结果

图2 致病性测定第7天结果

2.3 分子鉴定结果

对PCR产物进行测序，得到718 bp序列，经Genebank比对，与小菌核菌Sclerotiniaminor比对结果一致，与KF859921.1相似度达到100%，

3 小结与讨论

王晓青等[6]研究表明，生菜菌核病病原菌以核盘菌和小菌核菌为主，均属子囊菌亚门核盘菌科真菌。病菌在发病后期形成菌核，以休眠体形式长期存活于土壤中。本文的研究结果与前者基本一致，青浦地区生菜菌核病致病菌为小菌核菌Sclerotiniaminor为主。通过对病株和种子分离培养，在种子中未发现该病菌，结合田间发生症状，该病为土壤中带菌，不是种子带菌。

青浦地区的生菜腐烂由菌核病菌引起，该病主要发生时期在10月至翌年4月间发生较重，该时期为油菜菌核病发生重点时期，青浦地区油菜多种植在沟渠边，油菜菌核病和生菜菌核病是否有关系，后期将结合生物学特性和理化分析对该病菌进行分析，为后期防治研究提供参考。