失眠动物模型HPA轴和表观遗传修饰的变化及交泰丸的干预作用

赵俊云,杨晓敏,胡秀华,曹,简郭血骄,杨向竹,郭健

(北京中医药大学，北京100029)

失眠为睡眠障碍中最为常见的类型，其主要表现为入睡困难、早醒、睡眠质量低下和睡眠时间减少，继而造成注意力下降、记忆力减退等生理学改变。长期失眠还将导致精神疾患以及严重慢病的发生。流行病学研究显示，在一般人群中失眠的发生率约为27%，严重影响人群的生活质量，并增加了潜在的社会安全危害，成为重要的社会及医学问题，深入了解失眠的发生机制和寻找适当有效的治疗手段至关重要。下丘脑-垂体-肾上腺轴(The hypothalamic-pituitary-adrenal axis,HPA axis)的过度活跃被认为是失眠产生的重要生理学基础[1-2]。中医基于整体观对于失眠或称不寐进行了证型分类，临床上常运用方药、针灸等进行辨证施治。本文选取对氯苯丙氨酸(Para-Chlorophenylalanine，PCPA)致失眠大鼠模型为研究对象，心肾不交型方药交泰丸作为干预手段，通过观察血清HPA轴激素促肾上腺皮质激素释放因子(Corticotropin-Releasing Factor,CRF)、促肾上腺皮质激素(Adrenocorticotropic Hormone，ACTH)、皮质醇(cortisol)的水平评估HPA轴的活跃程度，通过观察血清表观遗传修饰的主要酶DNA甲基转移酶1[(DNA(cytosine-5-)-Methyltransferase 1，DNMT1]和组蛋白去乙酰化酶(Histone Deacetylase，HDAC)活性以及血清乙酰化组蛋白H3(Acetyl-Histone H3)水平的变化，探讨交泰丸干预失眠的生理学机制和表观遗传机制，为从整体观阐明方药的作用机理提供新的视角。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体质量(200±10)g，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司，SPF级，许可证号:SCXK(京)2015-0015。

1.1.2 药物与试剂

黄连和肉桂饮片购自北京同仁堂药店；PCPA购自Ark PharmLnc.(批号:AK-80383，纯度>98%);Elisa检测试剂盒均购自北京奇松生物科技有限公司。

1.1.3 实验仪器

3K15高速冷冻离心机(美国Eppendorf公司)，Safire2酶标仪(瑞士Tecan公司)。

1.2 方法

1.2.1 实验分组及动物模型建立

参考文献[3]的方法，将48只雄性SD大鼠适应1周后随机分正常组、模型组和交泰丸组。实验第1天，模型组和交泰丸组按300 mg/kg一次性腹腔注射 PCPA建立失眠模型，正常组一次性腹腔注射等体积生理盐水。实验第3天，交泰丸组灌胃交泰丸(黄连30 g，肉桂3 g)水提液(5 g/kg)，1次/d，连续3 d，正常组和模型组灌胃等体积生理盐水。

1.2.2 血清检测

实验第6天，大鼠用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，收集的血液样品经4℃静置1 h，4℃、3 500 rpm离心15 min，收集血清-20℃保存备用。血清按ELISA试剂盒说明进行各指标检测。

1.2.3 数据统计

2 结果

2.1 交泰丸显著降低失眠大鼠血清HPA轴激素水平

与正常组比较，模型组血清CRF、ACTH、Cortisol水平均上升，但差异无统计学意义;与模型组比较，交泰丸组血清CRF、ACTH、Cortisol水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。结果见表1。

表1 血清HPA轴激素水平

注：与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01

2.2 交泰丸显著降低失眠大鼠血清DNMT1活性

与正常组比较，模型组血清DNMT1活性显著上升(P<0.01)；与模型组比较，交泰丸组血清DNMT1活性显著下降(P<0.01)。与正常组比较，模型组血清HDAC活性下降，但差异无统计学意义；与模型组比较，交泰丸组血清HDAC活性下降，但差异无统计学意义。结果见表2。

表2 血清DNMT1和HDAC活性

注：与正常组比较，△△P<0.01；与模型组比较，**P<0.01

2.3 交泰丸显著降低失眠大鼠血清Acetyl-Histone H3水平

与正常组比较，模型组血清Acetyl-Histone H3水平上升，但差异无统计学意义；与模型组比较，交泰丸组血清Acetyl-Histone H3水平显著下降(P<0.01)。结果见表3。

表3 血清Acetyl-Histone H3水平

注：与模型组比较，**P<0.01

3 讨论

HPA轴是机体维持内稳态和调控应激反应的重要生理学基础。失眠过程中表现的生理上的过度兴奋一部分会体现为HPA轴的过度活跃。由下丘脑分泌的CRF是机体调节应激反应的关键因子，其分泌异常与多种精神疾病的发生发展有关。CRF可直接作用于腺垂体的促肾上腺皮质激素分泌细胞，可促进ACTH的分泌。ACTH可促进肾上腺皮质的组织增生以及皮质激素(Cortisol)的生成和分泌。当皮质激素的分泌水平过高时，将反过来影响垂体和下丘脑，减弱其分泌活动，因此，在皮质激素的负反馈调节机制下，HPA轴保持相对的平衡和稳态，对于调节睡眠-觉醒的节律性具有重要意义[1-2]。HPA轴激素在临床上已作为失眠及其他精神疾患诊断和治疗的重要标志物。本研究中，模型组的HPA轴较正常组稍显活跃，基本符合临床上失眠患者的激素水平的变化趋势，交泰丸干预3天后即可见失眠大鼠HPA 轴活跃度显著下降，说明交泰丸可通过调节HPA轴的功能来发挥治疗失眠的效果。同时，交泰丸的HPA轴调节作用从一定程度上为PCPA致失眠大鼠的心肾不交证型提供了证据，也为探讨心肾相关理论提供了实验依据。

表观遗传学已逐渐发展成为解读疾病的重要手段之一，相比较传统的分子生物学和基因组学，表观遗传学可从更宏观的层次对疾病的发生发展以及药物作用机制进行探讨，这与中医整体观的核心思想相契合。表观遗传学的范畴相当广泛，本文选取最为经典的DNA甲基化和组蛋白乙酰化修饰入手，尝试对证候和方药的表观遗传基础进行探讨。

DNA甲基化是最早发现的表观遗传修饰途径，在DNA甲基转移酶(主要是DNMT1)的作用下，目的DNA被甲基化修饰，从而改变DNA的构象和稳定性，进而改变DNA与蛋白质的相互作用方式，最终引起染色质结构的变化，从而引起染色质片段内大量基因功能的改变。因此，其效应可能涉及多个方面[4-5]。本文中，模型组血清DNMT1活性较正常组显著上升，说明模型组动物DNA甲基化水平相对升高，提示由于部分基因的表达受到了抑制，导致机体内稳态的破坏，无法正常应答外部刺激。交泰丸干预可以调节DNMT1活性，重新活化受抑制的基因，使机体恢复内稳态。

组蛋白修饰也是表观遗传修饰的重要途径之一。尽管不同种属的组蛋白是高度保守的，但组蛋白可在相关酶的作用下发生乙酰化、磷酸化、甲基化等修饰，进而对其结合的DNA片段上的基因功能产生影响。组蛋白乙酰化是发现最早，研究最多的组蛋白修饰过程，目前对组蛋白H3的赖氨酸乙酰化研究的最为清楚。组蛋白的乙酰化水平由组蛋白乙酰转移酶(histone acetyltransferase,HAT)和HDAC的活性共同决定。当HDAC结合到特定的启动子区，该区域组蛋白去乙酰化将导致基因转录的抑制[6-8]。本文中，模型组和交泰丸组血清HDAC活性均无显著变化，但模型组血清Acetyl histone H3水平较正常组有所上升，说明部分基因可能由于组蛋白H3的乙酰化而被激活，同样导致机体内稳态的破坏，也提示HAT与HDAC之间的平衡被破坏。交泰丸干预可能通过扭转HAT和HDAC的不平衡状态，使Acetyl histone H3水平下降，恢复部分基因的抑制状态。

通过本研究，可以确定的是方药对于机体表观遗传调控的可能性，通过DNA去甲基化修饰激活部分基因，同时通过组蛋白乙酰化修饰抑制部分基因，这样的调控机制非常符合中医药的整体观[9]。此外，本研究中还存在一些问题，如检测手段单一、检测指标不全、动物只选取了一种性别以及没有相关行为学评价等，将在后续研究中进行完善。基于本文探讨的心肾不交证型及方药，还将继续广泛深入探讨心肾相关理论的表观遗传机制，并可从表观遗传学角度探究证的发生与发展机制以及方药的药理作用机制，为中医药理论的现代研究开辟新的思路[10]。