时间分辨免疫荧光层析快速检测水产品中高效氯氰菊酯方法的建立

姜琳琳，苏 捷

(福建省水产研究所，福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室，福建 厦门 361013)

合成拟除虫菊酯类农药是有机磷和有机氯农药的替代品，在全球范围内占农药使用量的30%以上[1]。氯氰菊酯(CYP)又是拟除虫菊酯中应用最广泛的农药，有研究表明氯氰菊酯在水系统中的浓度约0.01～0.10 μg/L[2-3]。氯氰菊酯可以在水产品中富集[4]，干扰鱼类的生殖周期，引起细胞膜过氧化指标升高，损伤神经细胞[5]。而如果人食用了富集氯氰菊酯的水产品，会引起免疫系统和神经系统的损伤[6-7]。因此对水产品中氯氰菊酯的监测是必要的。

目前针对氯氰菊酯的检测主要有气相色谱法(GC-ECD)、气质联用法(GC-MS)、液相-串联质谱法(LC-MS/MS)、酶联免疫法(ELISA)等技术方法[8-13]。这些检测方法具有灵敏度高、结果稳定等优点，但是目前的检测技术前处理复杂，耗时长，难以适应检测任务量大的工作。时间分辨免疫荧光层析检测技术(TRFICA)，是利用待测抗原与标记铕(Eu)颗粒的抗体结合后通过毛细管作用沿着硝酸纤维膜层析，与层析试纸上包被检测抗原及质控二抗不同程度的结合，根据检测线和质控线的荧光强度强弱及其比值，可以分析待测样品中的抗原浓度。与常规检测技术相比，时间分辨免疫荧光层析检测方法省去了繁琐的加样、洗涤步骤，具有操作简单、适用于批量样品的快速筛选检测等优势。

本研究通过Eu标记氯氰菊酯类农药抗体，结合免疫层析技术，开发时间分辨免疫荧光层析快速检测卡用于常用农药高效氯氰菊酯的检测，通过精确度、稳定性实验，并与其它的检测方法进行比对，为进一步开发应用时间分辨免疫荧光层析快速检测卡检测高效氯氰菊酯奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验仪器

荧光读卡仪(上海杰一公司，JY1501FS)；旋涡混合器；冷冻离心机；喷金划膜一体机(杰一，Bio-line)；气相色谱仪(安捷伦6890N)；酶标仪(Tecan m 200)。

1.2 实验材料

南美白对虾采自厦门市场；高效氯氰菊酯(4.5%，广东真格生物)；Eu标记试剂盒(DELFIA)；氯氰菊酯抗原和抗体由项目组研制。

1.3 实验方法

1.3.1 抗体的Eu标记

参考Eu标记试剂盒的标记方法对氯氰菊酯类农药抗体进行标记。在包被有氯氰菊酯人工抗原的96孔板中分别加入稀释倍数为100、200、400、800、1 600、3 200、6 400的标记抗体，37℃孵育2 h，磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗6次，扣干，用酶标仪荧光模块检测荧光值，评价抗体的Eu标记效果，激发波长310 nm，发射波长610 nm，延迟时间300 μs。

1.3.2 氯氰菊酯免疫荧光层析检测卡的制备[14]

将玻璃纤维用喷金平台系统以15 μL/cm将Eu标记的氯氰菊酯类单克隆抗体喷在玻璃纤维上，37℃干燥2 h。用划膜系统以1 μL/cm将氯氰菊酯类偶联抗原(1 mg/mL)划在硝酸纤维素膜上，即为检测线； 在离检测线4 mm处喷上羊抗鼠IgG(1 mg/mL)，即为质控线，37℃ 干燥2 h。取出一块胶板，将喷有检测线和质控线的硝酸纤维素膜粘贴在中央区： 分别将吸水纸和胶金垫粘贴于硝酸纤维素膜的上方和下方，两者之间重叠约2 mm；再在结合垫的上方粘贴玻璃纤维作为样本垫，组装成免疫荧光层析快速检测卡，如图1所示。

注：1-结合垫；2-检测线T；3-质控线C；4-吸水垫；5-样品垫；6-硝酸纤维素膜；7-载体垫；8-卡式外壳；9-点样窗口；10-检测窗口。

Notes：1- combination pad；2- detection line T；3- quality control line C；4- water absorbent pad；5- sample pad；6- nitrocellulose membrane；7- carrier pad；8- card shell；9-point window；10-detection window.

1.3.3 标准曲线制作

取南美白对虾肌肉组织，用高速匀浆机绞成糜，置于磨口具塞试剂瓶中。试样于-18℃以下冷冻保存备用。将上述制得的样品于室温下自然解冻(在具塞试剂瓶中)，准确称取7份5 g绞碎的南美白对虾肌肉组织阴性样品于15 mL的离心管中，分别添加0、4、8、16、32、64、128 ng的高效氯氰菊酯标准品，加入正己烷-乙酸乙酯-丙酮(1∶2∶1，V/V/V)提取液15 mL后，漩涡震荡仪上振荡1 min，再超声提取5 min(频率 100 Hz)后2 000 r/min离心5 min。取上层有机相经装有无水硫酸钠的漏斗过滤至鸡心瓶。重复提取一次，合并提取液于40℃下旋转蒸发至近干。取10 mL乙腈溶液溶解旋干物后转移至新的离心管中，并用5 mL乙腈溶液洗涤鸡心瓶，将洗液合并至离心管中。向上述乙腈溶解物中加入15 mL乙腈饱和的石油醚，振荡1 min，使其充分混匀。混合液于4 000 r/min 离心7 min，弃去上层石油醚后取乙腈层，将其于 40℃下旋转蒸发至近干。加0.1 mL二甲基亚砜(DMSO)溶解旋干物后，再溶解于0.9 mL PBS中，备用于检测。分别取3滴添加到荧光检测卡的样品孔中，10 min后读取荧光读卡器中T线与C线的荧光响应值，以检测线荧光值T与控制线荧光值C比值(T/C)为纵坐标(y)，以标准溶液浓度为横坐标(x)，用ELISA Calc软件进行四参数逻辑曲线拟合，获得四参数拟合曲线和拟合方程y=f(x)。

1.3.4 样品检测

准确称取5 g绞碎的南美白对虾肌肉组织，参照标准曲线制作过程中的检测方法提取高效氯氰菊酯，用PBS溶解后，滴加到检测卡的样品孔中，根据检测线荧光值T与控制线荧光值C比值(T/C)和四参数拟合方程y=f(x)，可以计算出溶液中高效氯氰菊酯的浓度。

1.3.5 气相色谱检测方法

参考GB/T 5009.162—2008《动物性食品中有机氯农药和拟除虫菊酯农药多组分残留量的测定》标准对样品进行检测。

样品前处理：称取水产品肉样5 g，选择40 mL正己烷：丙酮(V/V，2∶1)混合溶液作为提取液，3 g中性氧化铝作为净化填料过柱净化，用30 mL正己烷：丙酮(V/V，4∶1)混合溶液作为淋洗液，氮气吹干，用正己烷定容，待上机。

气相色谱条件：安捷伦6890N型气相色谱仪(配有ECD检测器)，HP-5(5%苯基甲基硅氧烷)毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。载气为高纯氮气，流速1.0 mL/min；进样口和检测器的温度分别为260℃ 、310℃ ；色谱柱升温程序：初始温度100℃，保持1 min，以10℃/min 升至285℃，保持5 min。恒流方式，不分流进样，进样量为1 μL。

2 结果

2.1 抗体的Eu标记结果

表1 Eu标记氯氰菊酯抗体的荧光检测结果

对Eu标记的氯氰菊酯抗体(1 mg/mL)稀释不同倍数后，通过与包被有氯氰菊酯抗原的96孔板孵育反应，检测的的荧光值分析如表1所示，其中y=Fx/F100。由表1可以看出标记有Eu颗粒的菊酯抗体与96孔板上包被的抗原可以有效结合。对抗体稀释倍数和荧光比值用ELISA Calc进行四参数拟合，拟合曲线方程y=(A - D) /[1 +(x/C)^B]+ D，其中A为1.11，B为 1.55，C为466.40，D为0.013，决定系数R2为0.995 0；拟合曲线如图2所示。结果说明Eu标记氯氰菊酯抗体的浓度与待测组和对照组的荧光比值呈相关性，Eu标记氯氰菊酯抗体可以应用于竞争法检测未知抗原的浓度。

2.2 氯氰菊酯荧光检测卡的最低检测限与检测范围

根据1.3.2的方法，制备氯氰菊酯荧光检测试纸，如图3A所示。图3A中的3条试纸分别为未加样、添加0 ng/mL和128 ng/mL的荧光检测试纸，从图中可以看出未加样时，Eu标记的氯氰菊酯抗体在结合垫上，加样品溶液时在吸水纸的作用下，通过毛细管作用沿着硝酸纤维素膜层析，当样品中没有氯氰菊酯(-)时，Eu标记的抗体与T线包被的人工抗原结合，T线荧值升高，C线荧光值降低；当样品中有氯氰菊酯(+)时，Eu标记的抗体与C线包被的人工抗原结合，C线荧光值升高，T线荧光值降低。氯氰菊酯荧光检测试纸按图1的结构组合成检测卡，以方便使用。参考1.3.3的方法在对虾样品中添加0、4、8、16、32、64、128 ng的高效氯氰菊酯标准品，经提取后定容至1 mL，获得修正后的高效氯氰菊酯的标准溶液(文中所有的高效氯氰菊酯浓度都是以修正后的浓度计算)。取标准溶液3滴，滴加到检测卡的加样孔，用荧光读卡器扫描并读取荧光数值比值，如表2所示。对标准品浓度和荧光比值用ELISA Calc进行四参数拟合，拟合曲线方程y=(A - D) /[1 +(x/C)^B]+ D，其中A为8.81，B为1.35，C为3.02，D为0.19，R2为0.999 0；拟合曲线如图3B所示。通过做基质加标标准曲线，可以减少基质复杂成份对检测的影响，减少误差。将获得的A、B、C、D四参数输入到荧光读卡器中，就可以通过荧光读卡器检测样品中高效氯氰菊酯的浓度。

表2 标准品浓度与T/C值

设y=f(x)，差值百分比计算如公式(1)和公式(2)所示。

公式(1)

公式(2)

F(x)的曲线图如图4A所示，由图4A可以看出，随着x值的增加，F(x)值逐渐减小，说明随着x值的增加，f(x)变化减少，即荧光比值对样品的浓度变化灵敏度下降，当x<19.3时，F(x)>5%；G(x)的曲线图如图4B所示，由图4B可以看出，随着x值的增加，G(x)值逐渐增加，说明随着x值的增加，f(x)变化增加，即荧光比值对样品的浓度变化灵敏度增加，当x>0.35时，G(x)>5%。

根据G(x)公式计算的最低检测限计算结果，分别在10份虾肉样品中添加0.35 ng的高效氯氰菊酯，经提取后定容至1 mL，用荧光检测卡检测结果如表3所示。根据表3的结果可以看出当对虾样品中添加有0.35 ng高效氯氰菊酯时，可以被荧光读卡器检出，相对误差在0.5%～68.6%之间。因此根据实验结果该检测卡的最低检测限约为0.35 ng/mL。当浓度低于0.35 ng/mL时，样品组的C/T值与空白组的更加接近，以致仪器有时无法检测出具体数值。同理通过F(x)公式，可以计算出当样品中待测物浓度差异为1 ng/mL时，C/T差异大于5%时，x的范围即为检测范围。因此荧光检测卡的检测范围是1～19.3 ng/mL。

表3 对虾样品中添加最低检测限高效氯氰菊酯检测结果

2.3 氯氰菊酯检测卡准确度和精密度实验

由于氯氰菊酯检测卡批间生产和批内生产还存在生产上的误差，为满足检测的要求，对生产的3批次检测卡检测的准确度和精密度进行验证。通常可以用平均相对误差(AARD)表示检测结果的准确度，用变异系数(CV)表示检测结果的精密度。以检测范围的最低值1 ng/mL的2倍和4倍进行验证实验，结果如表4所示，由表4可以看出三批检测卡的平均相对误差在4.24%～8.66%之间，回收率在89.1%～109.1%之间，平均回收率为98.9%，检测卡批内变异系数在3.0%～8.6%之间，批间变异系数在4.8%～6.6%之间。

表4 对虾中氯氰菊酯检测卡检测的准确度和精密度结果

以气相色谱仪器的检测结果为真值，则检测结果相对误差的计算如公式(3)所示，其中RE是代表相对误差，R为气相色谱仪器的检测结果，R′是检测卡检测结果。

公式(3)

选用20个对虾样品，其中10个为阴性样，检测结果均为阴性；10个为随机加标样(1～4 μg/kg)，用检测卡检测结果与气相色谱检测结果(气相色谱法检测限为1 ng/mL)如表5所示。检测卡检测结果相对误差在8%～20%之间。对两种检测结果的相关性分析如图5所示，检测卡检测结果与气相色谱检测结果的线性方程为y=0.931 1x+0.045 4，相关系数R=0.989 9。结果说明氯氰菊酯检测卡的检测结果与气相色谱检测结果有良好线性相关，可以应用于对虾中高效氯氰菊酯的检测筛选工作。

表5 检测卡与气相色谱方法检测对虾中的高效氯氰菊酯结果

3 讨论

时间分辨免疫荧光分析(TR-FIA)检测方法是在ELISA技术上发展起来的，由于Eu原子受激发后荧光寿命较长(1 ms)，可以与本底受激发后产生的荧光明显分开，因此利用Eu颗粒替代辣根过氧化物酶(HRP)标记抗体，结合酶联免疫技术和带有时间分辨荧光模块的酶标仪可以实现对抗原的高灵敏定量分析。如Aceti利用TR-FIA方法对人体血液中的HIV病毒进行分析，灵敏度达到100%[15]；Liang Qianni等用TR-FIA方法分析鼻咽癌标志物Barr病毒，检测的线性范围为0～30 Au/mL，检出限为0.018 Au/mL[16]；Hiroko等用TR-FIA方法检测抗肺炎支原体(MP)IgM和IgG，最低检测限IgM为0.5 BU/mL，IgG为0.2 μB/mL；Huang Yukun等结合多色时间分辨荧光传感器实现检测牛奶中的多种葡萄球菌肠毒素(A、B、C1)目的[17]。

时间分辨免疫荧光层析技术是在时间分辨免疫荧光分析技术和胶体金免疫层析技术的基础上开发的一种新的技术，结合荧光读卡器可以实现对样品的快速的高灵敏度定量分析。利用该技术对枯萎病菌(PSS)进行分析，最低检测限为103CFU/mL，比ELISA方法的最低检测限低100倍[18]。采用时间分辨免疫荧光层析技术检测小麦、玉米、大豆和水稻等中的赭曲霉毒素A(OTA)，检出限为1 μg/kg，与液相色谱检测结果的相关系数R为0.985 4[19]。这些研究结果表明时间分辨免疫荧光层析技术无论是在检测医学还是在食品安全领域都有广阔的应用空间。

4.5%高效氯氰菊酯乳油主要含有高效反式异构体(S 1R 3S和R 1S 3R)和高效顺式异构体(S 1R 3R和R 1S 3S)，两种高效体按4.5%的浓度配制而成[21]。这两种高效异构体如图6A～D所示[20]。氯氰菊酯人工抗原是由3-间苯氧苯甲酸(结构如图6E所示)通过二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)与血蓝蛋白(KLH)偶联获得，制备的氯氰菊酯抗体可以与二苯醚结构结合。高效氯氰菊酯都含有二苯醚结构，因此可以通过氯氰菊酯抗体检测高效氯氰菊酯。在水产品的氯氰菊酯的残留主要也是以图6中的4种高效氯氰菊酯异构体形式存在，所以本方法通过自制的氯氰菊酯抗体检测水产品的高效氯氰菊酯总量。

本研究通过Eu颗粒标记氯氰菊酯抗体，研发针对高效氯氰菊酯检测的时间分辨免疫荧光检测卡，对高效氯氰菊酯的最低检测限可以达到1 ng/mL或0.2 μg/kg，与邱明[22]等采用气相色谱法(GC-ECD)检测水产品中氯氰菊酯的最低检测限一致，略高于国标GB 29705—2013对水产品中氯氰菊酯的最低检测限(1 μg/kg)。 通过与国家标准方法检测结果的相关性分析，本技术方法检测结果符合预期要求。由于高效氯氰菊酯在农业上的广泛使用，使动植物中经常会有高效氯氰菊酯的残留，因此本技术方法在生态保护、食品安全等领域将具有重要的开发应用前景。

4 结论

本研究通过Eu颗粒标记可以与二苯醚结构特异性结合的氯氰菊酯抗体，研发针对水产品中高效氯氰菊酯检测的荧光检测卡，通过在对虾样品中添加高效氯氰菊酯标准品分析检测卡的最低检测限、准确度、精确度等指标，研究发现氯氰菊酯检测卡的最低检测限为0.35 ng/mL，检测范围是1～19.3 ng/mL，检测卡的平均相对误差在4.24%～8.66%之间，批内变异系数在3.0%～8.6%之间，批间变异系数在4.8%～6.6%之间，检测卡检测结果与气相色谱检测结果的线性相关系数R=0.989 9。结果表明本技术方法可以应用于水产品中高效氯氰菊酯的快速定量检测。