几丁类寡糖构效关系及植物免疫诱导活性研究进展

王 倬，曾粮斌，袁善奎，李建军，杜昱光*

(1.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 100190) (2.中国农业科学院麻类研究所，湖南 长沙 410205) (3.农业部农药检定所，北京 100125)

几丁质(chitin)，又名甲壳质、甲壳素，常见于甲壳类动物、昆虫外壳以及真菌细胞壁，是自然界产量仅次于纤维素的天然多糖，年产量约为1011吨[1]。几丁质及其脱乙酰化产物壳聚糖(chitosan)因其具有的多种生物活性，良好的生物可降解性及生物相容性，已被作为一种优秀的天然材料应用于诸多领域。然而，几丁质及壳聚糖较差的水溶性一定程度上限制了其更广泛的应用，其降解得到的低分子量寡糖产物(chitooligosaccharide)水溶性良好，且在抗炎、抗菌、抗癌、免疫调节、细胞修复、植物免疫诱导等多方面展现出更好的生物活性[1-4]，在医药、食品、化妆品以及农业等诸多行业展现出巨大的应用潜力[5-7]，相关产业近些年成长迅速。

1 分类定义

Chitooligosaccharides在中文中通常被称为壳寡糖、几丁寡糖或低聚壳聚糖，是由N-乙酰氨基葡萄糖及其脱乙酰化产物氨基葡萄糖组成，是聚合度<20、平均分子量<3.9 kDa的低聚糖链[5]。如同其制备原料几丁质与壳聚糖，chitooligosaccharides也常被分为两类：一类是脱乙酰度(DD)>70%的，通常称为壳寡糖(chitosan oligosaccharides)，农业上也称为氨基寡糖素；另一类是脱乙酰度较低，<50%的，称为几丁寡糖(chitin oligosaccharides)。这种分类方法很大程度上源于寡糖制备工艺方法局限性。传统工艺中，因为几丁质不溶于水、碱和有机溶液，只溶于部分浓酸，因此甲壳类原料首先通过加入强碱脱乙酰生产可溶于稀酸的脱乙酰度>70%的壳聚糖，从而实现工业上的大规模制备。以此壳聚糖为原料降解制备壳寡糖的，其脱乙酰度也在这个范围。随着对chitooligosaccharide研究的进一步深入，这种分类及中文命名方式出现了一些问题，比如对脱乙酰度在50%～70%之间的寡糖缺乏定义，而这类被称为hetero-chitooligosaccharides的寡糖由于其更优的生物活性及物理化学性质，已成为壳寡糖研究领域及相关产业的最新热点[1,4]。可以看出，chitooligosaccharide类寡糖的分类及中文命名存在很多定义不清以及命名混淆的状况。在本文中为便于叙述，我们定义脱乙酰度>70%的为壳寡糖(chitosan oligosaccharide，COS)；脱乙酰度<50%的为几丁寡糖(chitin oligosaccharide，CTOS)；脱乙酰度在50%～70%之间的为HT-壳寡糖(hetero-chitooligosaccharide，HT-COS)；而这些寡糖统称为几丁类寡糖(chitooligosaccharide)。尽管脱乙酰度是几丁类寡糖分类的重要依据，寡糖的聚合度(DP)、分子量(MW)、分子量分布(PD)以及乙酰化分布模式(PA)等结构特征均直接影响几丁类寡糖的生物活性，并可以依照这些特征进行更细致的分类[8]。

2 生产工艺技术研发

目前，几丁类寡糖主要通过物理、化学方法或酶法降解壳聚糖或几丁质制备生产。几丁类寡糖的物理降解研究相对较少，方法主要包括超声降解[9]及γ-辐照[10]，工业制备主要通过化学法及酶法。传统化学法制备工艺主要使用强酸降解，包括酸解、中和、分离、干燥等步骤[11]。除了使用强酸降解，双氧水也可以用于寡糖制备[12]。化学降解方法步骤较复杂，且较难控制寡糖产物的聚合度、脱乙酰度等结构特征，其寡糖产物的聚合度较低，而生物活性更优的高聚合度寡糖产物较少[11]。此外，还存在副产物较多、环境不友好等问题。相较而言，酶法制备是更有效、应用更广泛的方法。酶法制备可使用特异性的几丁质酶和壳聚糖酶，也可以使用非特异性的糖苷酶以及蛋白酶。酶法降解具有高效、反应温和、产物结构可控、环境友好无污染等优点，适用于几丁类寡糖生产制备。

3 植物免疫诱导活性研究与应用

研究发现，几丁类寡糖具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗氧化、免疫调节、降血脂以及降血压等多种生理活性[13,14]，在医疗、保健、食品等领域已有广泛的应用(表1)。在农业应用方面，几丁类寡糖因为具有激活植物免疫系统的活性，而被作为植物诱导剂广泛应用(表1)。研究表明，几丁类寡糖的植物免疫诱导活性受其浓度、聚合度、脱乙酰度、施用方法、植物生长周期等多方面因素影响[15]。几丁寡糖的植物作用活性研究开展较早，其在植物上的特异性受体也已发现[16,17]。研究表明，聚合度>3的几丁寡糖具有较强的植物诱导活性，与相同聚合度的壳寡糖相比活性更好。几丁寡糖的活性更高的原因或在于其主要由N-乙酰氨基葡萄糖组成，而单糖上的乙酰基团对于寡糖与受体的结合至关重要。因此，更高聚合度的几丁寡糖往往活性更强。但是，高聚合度(DP>8)的几丁寡糖在水和有机溶液中的溶解性均很低，且目前几丁寡糖生产工艺较为复杂，限制了其更广泛的应用。相较而言，壳寡糖在植物免疫诱导活性方面的研究更为深入，在我国已有多种氨基寡糖素类农药获得了登记许可。壳寡糖的植物免疫诱导作用机制可能与几丁寡糖存在差异，其在植物上的特异性受体也尚未发现。目前认为，壳寡糖暴露的氨基所携带的正电荷是其活性的重要基础，壳寡糖或通过此特性与细胞膜结合，或进入细胞内与核酸结合影响相关基因的表达[15]。尽管壳寡糖的作用机制尚待更多研究确定，但在多种植物上的研究及应用证明，壳寡糖可以促进植物生长[18]、激活植物天然免疫系统[6,15]，从而提高植物抗病、抗虫能力，增强抗逆性(抗旱、抗寒、耐盐)。此外，在实际应用中我们发现，壳寡糖可以促进植物降解农药从而降低农产品的农药残留。因此壳寡糖作为天然、无毒、环境友好的新型生物农药、肥料及生长调节剂，已被广泛应用于农业生产。与几丁寡糖类似，研究发现聚合度≥3的壳寡糖具有较高的植物免疫诱导活性[19]。

表1 国内几丁类寡糖产品信息汇总

注：*产品分类参照本文分类定义方法；本表数据参考农业行业标准NY/T2889.1-2016、行业标准HG/T 4926-2016、国家卫生计生委公告(2014年第6号)

4 构效关系研究

近期研究表明，脱乙酰度50%及68%的HT-壳寡糖植物诱导活性比传统壳寡糖更强[20]。目前研究认为，HT-壳寡糖既有足够数量的乙酰基团参与植物表面受体结合，从而更有效的激活植物免疫系统，其所具有的正电荷也可以发挥壳寡糖的活性作用，同时在较高聚合度(DP>8)的情况下仍具有较好的水溶性，因此已成为几丁类寡糖最新的研究方向。此外，HT-壳寡糖的脱乙酰化程度更接近于自然界中真菌细胞壁几丁质/壳聚糖的脱乙酰度范围，这一特征也可能是其优良植物免疫诱导活性的结构基础，因为真菌细胞壁组分正是植物天然免疫系统的识别信号。然而，这种脱乙酰度范围也带来HT-壳寡糖结构上的复杂性，给HT-壳寡糖的分离纯化与结构鉴定带来挑战。以脱乙酰度50%的杂壳四糖为例，在聚合度和脱乙酰度相同的情况下，其单体均由2个氨基葡萄糖和2个N-乙酰氨基葡萄糖组成，但从糖链还原端到非还原端不同的单糖排列顺序可以产生6种不同结构的寡糖单体。这一新的发现极大增加了几丁类寡糖的结构复杂性(图1)。近期研究通过使用特定的几丁质酶、壳聚糖酶及脱乙酰酶，结合分离纯化方法的改进，以及质谱、NMR等结构鉴定技术的发展，制备了种类多样、结构确定的HT-壳寡糖单体[21,22]，为HT-壳寡糖构效关系的深入研究及应用奠定了基础。令人惊讶的是，体外植物细胞活性实验表明，仅仅一个乙酰化位点不同，这些寡糖同分异构体的生物活性相差很大[23]。我们近期也开发了基于特定酶的几丁类寡糖绿色清洁化生产工艺，制备了聚合度、脱乙酰度、乙酰化分布模式可控，结构明确的HT-壳寡糖及几丁寡糖。室内及田间试验表明，这些寡糖展现出良好的植物免疫诱导活性，其免疫诱导抗病、抗虫活性是传统高脱乙酰度壳寡糖产品的数倍。

图1 几丁类寡糖结构特征示意图

5 讨论

综上所述，几丁类寡糖在健康产业、农业等方面已显现出巨大的应用价值，以聚合度为主要特征的第一代高脱乙酰度(DD>70%)壳寡糖产品在多个领域被成功开发，在农业应用上已有60多种氨基寡糖素农药获得登记证。然而，目前几丁类寡糖产品类型单一，所开发的农药、饲料添加剂及功能食品产品均属于本文所述壳寡糖的范畴(表1)。此外，目前产品结构表征相对不足，一般仅对聚合度和脱乙酰度有较为笼统的限定，造成相关产品质量水平良莠不齐。越来越多的研究表明，寡糖的生物活性受聚合度、脱乙酰度、乙酰化分布模式等结构特征的影响而产生巨大差别。因此，对于壳寡糖类产品需要更科学系统的结构表征及分类规范。HT-壳寡糖因其结构与天然免疫诱导结构更近似带来高活性特点，目前随着绿色清洁化可控酶解制备工艺的成熟，第二代聚合度可控，脱乙酰度范围更接近自然状况的壳寡糖类产品即将面世。而随着定点脱乙酰化技术的不断成熟及制备、检测技术的完善，未来还将出现三大结构特征明确可控(即聚合度、脱乙酰度、乙酰化位点)的第三代壳寡糖类产品。这些寡糖产品对制备技术提出了更高、更科学的要求，但也将具有更广阔的应用前景。