农药相关杂质的评价与判定

李国平，宋俊华，张宏军，吴进龙，陈铁春

(农业部农药检定所，北京 100125)

对农药的安全性评价，除了有效成分之外，原药和制剂产品中的杂质也是重要的因素，尤其是相关有害杂质的判定和分析。建立相关杂质的限量标准不仅直接关乎农药产品的使用效果，并且对人体健康、环境安全和农产品质量安全产生重要影响，农药相关杂质管理已成为各国农药登记管理的重要内容。

1 相关杂质的概念

农药原药中的杂质主要是合成过程中产生的副产物、残留的原材料、储存过程中的分解产物和原材料带入的杂质。农药制剂中的杂质则主要来源于加工使用的原药和助剂或者加工或贮存过程中产生的杂质。

当杂质与其所相关的有效成分相比，对人类和环境具有明显毒害、对施用作物产生药害、引起农产品污染、影响农药产品质量稳定性或引起其他不良影响，则该杂质称作相关杂质，即杂质的相关性和其与有效成分的相对危害有关。因此，在两个不同有效成分中存在的同一杂质，可能分别定义为相关和非相关，或在不同的有效成分中适用不同的最大允许限量。另外，杂质的相关性不仅由所产生的危害确定，如果在实际使用过程中有证据表明其没有显著危害的可能，则一个潜在相关杂质也可被定义为非相关杂质。

2 杂质相关性的判定

杂质相关性的判定是对实际情况进行科学评价做出的结果。在缺乏数据或相关信息进行更精准评价的情况下，FAO/WHO农药标准联席会议(JMPS)通常默认采用全球化学品统一分类和标签制度(GHS)对于混合物的分类标准。如，对于皮肤和眼刺激物设定标准为10 g/kg，对于具致敏性、致突变性、致癌和生殖毒性的化合物为1 g/kg。GHS承认在一些情况下对准则有所偏离是必要的或合理的。如果有数据支撑，JMPS将优先评估得出最大可接受限量，即对整体危害构成的影响可忽略时的剂量浓度，而不是采用GHS的限量。作为默认的方法，当原药产品中的杂质含量≥最大可接受浓度的10%，即为相关杂质。因此对于皮肤和眼睛刺激物，当含量达到1 g/kg时即为相关杂质，对于具致敏性、致突变性、致癌和生殖毒性的化合物则为0.1 g/kg。

对于有器官毒性的化合物(如通过LD50、LOAEL、NOAEL、BMD、BMDL、ADI等进行定义的)，通过计算得出最大可接受浓度，超过其10%即有相关性。

2.1 最大可接受浓度法 对于与有效成分相比，毒性危害相似(加和效应)的杂质，JMPS采纳的最大可接受浓度即为导致有效成分整体危害增加10%时的含量。同样，10%的临界值也适用于有效成分和杂质的相关毒理学数据都已知，可以对适宜的ADI/ARfD值进行比较。用10%作为临界值可能比较随意，但可认为其代表了增加的危害可忽略时的情况。如果缺少可用于进行比较的毒理学数据，最大可接受限量将视情况而定。

在评价与有效成分有“加和效应”的杂质的相关性时，JMPS使用“剂量-加和”模式，该模式可以表示为：

(1)

其中Cai和Cimp是活性成分和杂质的浓度，TOXai、TOXimp和TOXTC是活性成分、杂质和原药(TC)的毒性。应当指出的是，TOXai值通常是不存在的，TOXTC代表所评估的具体原药的值。

如前所述，毒性增加的最大可接受值是10%，10%的毒性增加被认为是可以忽略的。在不存在其他毒的杂质情况下，可以从公式(1)推导出:

(2)

从而推导出：

其中Cimpmax值为杂质的最大可接受浓度。如果有超过一种相关杂质，则可以使用不同杂质的相对毒性来计算可接受的杂质的总量。如果杂质的实际最高浓度(生产质控标准)<上述计算的Cimpmax值的10%，则通常认为该TC的杂质不相关。

例1：某原药的急性口服LD50是1 000 mg/kg bw，杂质的是100 mg/kg bw。TC的最小纯度为920 g/ kg，由五批次全组分分析支持的杂质的生产质量控制极限为2 g/kg。

因此，杂质浓度可接受的最大限度是10 g/kg。相对于920 g/kg的TC最小纯度，10 g/kg的杂质浓度是可能的。此外，生产质控极限2 g/kg超过最大可接受极限10 g/kg的10%，因此杂质是相关的。

例2：某生物农药的最低纯度200 g/kg。一种杂质的急性口服LD50为2 000 mg/kg bw，活性成分为1 000 mg/kg bw。也就是说，杂质比活性成分的危害小。由五批次全组分分析支持的杂质生产质控限值为20 g/kg。

因此，杂质浓度可接受的最大限度是200 g/kg。用200 g/kg的TC最小纯度，可以达到200 g/kg的杂质浓度。生产质控限值20 g/kg=最大可接受限度的10%，因此杂质是相关的。

例3：某原药的急性口服LD50是600 mg/kg bw，某个杂质的是400 mg/kg。TC的最小纯度为980 g/kg，由五批次全组分分析支持的生产质控限制为5 g/kg。

修约至1位有效数字(7×10)，杂质浓度可接受的最大限度为70 g/kg。相对于980 g/ kg的TC最小纯度，70 g/kg的杂质浓度是不可能的。此外，生产质控极限5 g/kg<最大可接受极限70 g/kg的10%，杂质是不相关的。

需要指出的是“剂量-加和”模式不适用于致癌性、致突变性、致畸性，或眼睛和皮肤刺激性、以及致敏性等终点数据。对于这些终点数据，默认的方法是使用GHS对于混合物的分类准则。

2.2 未达定量水平杂质相关性的评估 如果生产、储存过程，根据化学反应理论推断有可能存在相关性的杂质，但由于方法检出限等技术原因未检出或未达到定量限时，应按下述原则评价和判定。

2.2.1 杂质偶尔出现在实际生产批次产品中，但混合批次产品中未达定量水平，则采用混合前量值按照上述2.1程序评估杂质危害程度。

2.2.2 有证据或经验表明，在有效成分生产中可能产生杂质，但出现下述(1)、(2)、(3)的情况时，则可认定为非相关杂质，但应在产品质量标准中注明。

(1)在评估产品中从未达到检出水平；

(2)采用的工艺不可能产生该杂质；

(3)杂质可能来源于生产的起始原料，但经评估，申请产品的生产商实际使用的原料中不会出现。

2.3 遵从国家农药管理规定 有些杂质已被国家农药管理机构或相关国际组织根据已有的科学数据确定为潜在的相关杂质，它们有致畸、致癌、神经毒剂、生殖毒性，如：苯胺和取代苯胺类，硫酸二甲酯类，二氯联苯三氯乙烷(DDT)类，乙撑硫脲(ETU)和丙烯硫脲(PTU)类，卤代二苯并二噁英类，卤代二苯并呋喃类，肼和取代肼类，亚硝胺类，有机磷酸酯氧化物类，四乙基硫代二磷酸盐(治螟磷)类，有机磷酸酯和氨基甲酸酯的亚砜和砜化物类，氯化偶氮苯类，甲基异氰酸酯类，多氯代联苯(PCBs)和六氯苯(HCB)类，苯酚类等。对这些类杂质，若根据科学和经验推断产品中有可能存在时，均需进行评价。

3 相关杂质的限量标准

如果在实际的生产工艺中，发现标准限量低于可接受限量，JMPS通常将优先采用标准限量。

标准中相关杂质限量标准的最大值采用有效成分含量的 g/kg来表示。个别情况下，当有证据表明相关杂质的浓度与有效成分加工、稀释等影响相关联时，该最大值可采用制剂产品的 g/kg来表示。规格标准中要分别对每种相关杂质规定不同的条款。相关杂质的检测平均值不能超出限量规定的最大值。分以下3种情况：

(1)≥1 g/kg的相关杂质，限量标准参照全组分分析报告(至少5个有 代表性的批次)中研究确定的结果(目前要求提供GLP五批次全组分分析报告)制定，申请者应对制定依据给出明确解释(例如，在实际生产中发现的最高剂量，或实际生产中所测平均值加3倍标准偏差等)。相关杂质的限量标准一般用五批次全组分分析报告研究结果的平均值加上3倍标准偏差表示。

如使用同一工艺在1个以上地方生产，应提供至少2个生产点的五批次全组分分析报告，且反应了典型极端情况下的杂质数据。

(2)含量<1 g/kg的相关杂质，限量标准同样参照全组分分析报告(至少5个有代表性的批次)中研究确定的结果(目前要求提供GLP五批次全组分分析报告)制定，申请者也需给出制定依据。

(3)对观察到的相关杂质的毒副作用给出解释，如毒理学效应、对有效成分稳定性的影响等。JMPR或注册机构制定的限量标准应该附有上述解释，以示对限量标准制定的权威性。

4 相关杂质分析与分析方法验证

我国及FAO/WHO等国家和组织要求，在制定农药产品相关杂质限量标准时，必须同时建立一套具有可操作性、符合相关杂质限量检测要求的、与农药质量监测系统及生产相适应的杂质定性定量分析方法。相关杂质的分析方法至少应经过等效性确认，若还没有已公布的分析方法和方法等效性确认资料，则申请人应向注册机构提交这些资料。

4.1 相关杂质的定性分析 我国要求申请者在提交的原药全组分分析报告中，提供原药中杂质红外光谱、核磁共振谱和质谱中至少1种定性试验方法及色谱保留时间、解析过程、结构式、通用名称或化学名称及相关谱图。

4.2 相关杂质的定量分析

4.2.1 定量分析方法

4.2.1.1 应采用标准品对照定量法，分析方法应进行确认。

4.2.1.2 采用国家标准、行业标准或国际农药分析协作委员会(CIPAC)等国际通用方法的，仅需进行部分方法确认。方法确认包括线性关系、精密度和定量限等。4.2.1.3 对于实验室自行开发的方法，应进行方法确认。方法确认包括特异性、线性关系、精密度、准确度、检出限和定量限等。

4.2.2 定量分析方法确认

4.2.2.1 特异性 特异性可通过与另一种已证明是合适的、分离或检测原理不同、或具有较强分辨能力的方法进行结果比较来确定。通常可使用气相色谱-质谱联用仪(GC/MS)、液相色谱-质谱联用仪(LC/MS)或者二极管阵列检测器(DAD)进行测定，确认其特异性。

4.2.2.2 线性关系 被测相关杂质响应的线性范围，至少应≥其标准限量标明浓度的±20%。至少测定3个浓度，每个浓度测定2次，应附上线性关系图、斜率、截距和相关系数等数据。测得的斜率可证明响应与分析物浓度之间有明显的相关性。在标明值±20%范围内，其结果不应与线性有显著偏离，一般相关系数(r)应>0.99，否则需提供如何保证方法有效性的说明。如由于特殊需要使用不成线性响应的方法，必须做出解释。

4.2.2.3 精密度 精密度可用重复性试验进行考察。重复性试验需至少进行5次样品的平行测定，并计算相对标准偏差，用RSDr表示。

要求：RSDr<2(1-0.5 1ogC)×0.67

式中：C为样品中待测物浓度，以小数计(如待测物浓度为20%，C=0.2)。

对于测定结果中的偏离数据，可用Dixon法或Grubbs法检验，但要舍去某些结果时，必须明确指出，并应解释产生偏离的原因。

4.2.2.4 准确度 评价方法的准确度，可采用添加回收率试验，即在已知被测组分含量的样品中精确加入一定量的被测组分标准品，再进行测定，计算回收率。加标后被测组分浓度应在线性范围内。

回收率=(测得量-原有量)/加入量×100%

进行添加回收率试验时，在标准规定限量指标水平上，至少进行2个添加回收试验。可以配制与待测组分含量测定时浓度相同的5份样品(样品取样量减半，按1:1比例加入标准品)，也可以配制3个不同浓度的样品(样品取样量减半，按0.8:1、1:1、1.2:1比例加入标准品)，每个浓度平行做2份，共6份。

添加回收率应符合下列要求：

相关杂质标准限量浓度(%)添加回收率(%)> 190～1100.1～180～120<0.175～125

4.2.2.5 灵敏度 灵敏度可用检出限(LOD)和定量限(LOQ)评价。分析方法的检出限是指样品中被测组分能被检出的最低量，但并不要求可定量检测，一般用信噪比为3时物质的量或浓度来表示。分析方法的定量限是指样品中的被测组分在适当的精密度和准确度下可准确进行定量检测的最低量或浓度，是低含量组分如杂质或降解物定量分析中的重要参数，一般用信噪比为10时物质的量或浓度来表示。在进行低含量相关杂质组分分析时，定量限需要低于规定限量，以便能够测定可能存在于样品中的痕量杂质，通常在1/10～1/2之间。

5 小结

世界各国日益重视农药的生态安全和环境保护，逐步加强农药管理方面的立法，更加重视农药的风险评估工作。近年来，FAO/WHO、欧盟、澳大利亚等国际组织和国家对农药相关杂质的管理要求不断提高，分别对农药原药的杂质限量进行了规定。

2017年我国新修订的《农药管理条例》及配套规章陆续颁布实施，农药具有毒理学意义的相关杂质的评价与判定，对我国农药登记资料的技术审查至关重要。借鉴和参考FAO/WHO及发达国家关于农药相关杂质的管理，对于提高我国农药相关杂质的科学管理水平具有重要的意义。