小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素的气相色谱法检测及毒素污染去除分析

张正炜，成 玮，沈慧梅，田如海，武向文，郭玉人，占绣萍,2*

(1.上海市农业技术推广服务中心，上海 201103；2.上海市农药检定所，上海 201103)

脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)是镰刀菌属产生的一种B型单端孢霉烯族真菌毒素，对动物和人都具有很强的致呕吐能力，因此又被称为“呕吐毒素(Vomitoxin)”。DON主要存在于小麦、大麦、燕麦、黑麦、玉米、大米等谷物及其制品中，在全球范围内具有很高的污染率。我国谷物在田间普遍存在镰刀菌毒素污染，小麦被感染镰刀菌后成为赤霉病变，我国谷物及其制品如玉米、玉米面(渣、片)、大麦、小麦、麦片、小麦粉中DON的限量标准为≤1mg/kg[1]。

有关谷物中的分析方法，文献报道了气相色谱(GC)[2-7]、气质联用(GC-MS)[8-9]、液相色谱(HPLC)[10-18]、酶联免疫法(ELISA)[18-21]、液相-质谱联用(LC-MS)[22-25]等多种方法，文献中色谱法所采用的样品预处理较为复杂，都需要经过不同程度的净化，使用较为昂贵的固相萃取小柱和耗费大量的有机溶剂。然而GC-MS、LC-MS等质谱仪器非常昂贵，很多基层检测机构不能配置到位。本文通过气相色谱仪检测，前处理方法通过反复筛选提取方式、提取时间，指出衍生化的关键点，优化色谱条件，无需净化，简化了操作步骤，缩短了样品处理时间。适合基层检测机构实验室快速开展日常的小麦DON监管工作。

通过市场面粉抽检发现，大多数品牌面粉都不同程度的含有DON毒素；对小麦进行田间调查与取样中发现，看似健康的麦粒中，同样极有可能感染着DON毒素的风险，有些甚至超过国家标准，所以从食品安全角度考虑，农业政府部门应该严格监测与监管小麦等谷物及其制品中DON含量。

1 材料与方法

1.1 仪器 GC7890气相色谱仪带ECD检测器(美国安捷伦公司)、色谱柱HP-5(30m×0.32mm×0.25μm)、中药粉碎机(上海淀久中药机械制造有限公司)、离心机(上海安亭科学仪器厂)、漩涡混合器(上海皓庄仪器有限公司)、摇床(德国Julobo振荡水浴)、数控超声波清洗器(昆山和创超声有限公司)、电子天平(Sartorius公司)等。

1.2 样品与试剂耗材 小麦粉阴性和阳性样品：农户种植和超市、农贸市场购买。

DON标准品(纯度>99%，FERMENTEK Ltd，for research use only)；三甲基硅烷咪唑TMSI(纯度≥98.0%,上海麦克林生物有限公司)和三甲基氯硅烷TMCS(分析纯，上海润捷化学试剂有限公司)，异辛烷(色谱纯)，实验用水为Millipore制备的超纯水，0.22μm的有机滤膜，一次性针筒。

DON标准储备液：用甲醇将DON标准品配制成20mg/L的DON标准储备液，置于-20℃的冰箱保存，使用时稀释成所需质量浓度的DON标准工作液。

衍生化混合试剂配制：将三甲基硅烷咪唑TMSI和三甲基氯硅烷TMCS以100:1(体积比)混合，现配现用。

1.3 样品前处理

1.3.1 提取 将脱壳后的小麦粒均匀打磨成面粉，面粉称取5 g，加入乙腈/水(ν:ν=84:16)溶液25 mL，超声波超声15min或置于摇床上振荡2 h。再以5 000 r/s的速度将样品离心2 min，吸出上清液5mL至离心管中，置于60℃水浴锅中氮吹至干(或者置于通风厨过夜)，样品须充分吹干，不可有水分，否则影响下一步反应。

1.3.2 衍生化 在样品管加入0.5 mL以上混合好的衍生化试剂，在漩涡混合器振荡1 min令充分反应。加入异辛烷5 mL，充分摇晃后，以5 000 r/min离心1 min。再在每个样品管中加入2 mL去离子水，与过量的衍生化试剂反应，稍加振荡，静置分层，吸取上层溶液，过膜，待测。

1.4 仪器条件 气相色谱柱：HP-5(30m×0.32mm×0.25μm)；进样口温度：250℃，检测器温度：250℃；柱温：采用程序升温，初始温度120℃，保持0.5 min，以40℃/ min的升温速率上升到180℃，保持0.5 min，以30℃/min的升温速率上升到280℃，保持5 min；载气：高纯氮(纯度99.999%)，流速1.8 mL/min，尾吹 20 mL/min；进样量：1 μL。

2 结果与分析

2.1 样品提取方式和提取时间的优化 为了减少操作步骤和提高样品提取效率，以满足大量样品分析检测的要求，本实验采用振荡和超声提取2种方式比较，在空白样品中添加0.2 mg/kg，3个重复。试验了在振荡条件下，提取1、2、8、12、24 h等5个时间段进行振荡比较，结果表明，振荡提取2 h的提取效率即能满足要求；在超声波振荡条件下，提取10、15、20、30、60 min等进行提取比较，发现15 min提取效率即能满足要求。所以，建议根据各自实验室条件选择振荡2 h 或者超声15 min均能满足方法要求。具体结果(表1)。

表1 提取方式和提取时间的回收率结果比较

2.2 样品衍生化的关键 由于提取剂是用乙腈/水混合提取，提取剂中含有水，所以必须要充分吹干或者充分晾干，否则衍生试剂将优先和水分反应，而不能和DON正常衍生化反应。试验表明，如果提取剂中水分没有吹干，加入衍生试剂时，会有放热反应，并发出“吱吱”的声音，此时DON不能正常发生衍生反应，DON衍生产物几乎检测不出 。

2.3 色谱条件的优化 试验从环保、精简前处理目的出发，所以对色谱条件的设置就较严格，需要将杂质与标样进行分离，本文通过调节氮气流速、柱子起始温度、程序升温等条件，将杂质和标样较好的分离及标样较快的出峰，经过HP-5毛细管色谱柱分离，空白样品、标样和添加回收率的谱图(图1～3)，保留时间为6.19 min。

图1 DON标准品衍生产物气相色谱图-0.1mg/L

图2 小麦粉空白样品衍生后气相色谱图

图3 DON标准品添加回收柱前衍生产物气相色谱图-0.2mg/L

2.4 方法的线性范围及检出限 在优化的实验条件下，用甲醇将20 mg/L的DON标准储备液，分别稀释成0.01、0.025、0.1、0.25、0.5、1.0 mg/L 6个不同质量浓度的标准溶液，摇匀，衍生化处理后，按照1.4仪器检测条件，以峰面积对进样绝对量做标准曲线，检测线性范围为0.01 ～1 ng，得到线性回归方程为y=55 578x-797.5，相关系数R=0.998 5 。在上述条件下，DON的最小检出量为0.01 ng。根据添加回收率实验，在上述色谱条件下DON在小麦粉中的最低检测浓度为0.01 mg/kg。

2.5 添加回收率和方法的精密度 在空白小麦粉中添加DON标准溶液，添加水平分别为0.04、 0.2、 1.0 mg/kg，每个水平6次重复，按上述方法进行提取、衍生化和测定。结果(表2)表明：在0.04～1.0 mg/kg添加水平下，DON的平均回收率在93.8%～108.5%，相对标准偏差为4.3%～8.6%，准确度和精密度符合分析要求。

表2 DON在小麦粉中添加回收率及相对标准偏差

2.6 定量结果计算 样品中被测毒素含量以质量分数ω计，单位mg/kg，按以下公式计算。

ρ——标准溶液中毒素的质量浓度，mg/L；

A——样品溶液中被测毒素的峰面积；

AS——毒素标准溶液中被测毒素的峰面积；

V1——提取溶剂总体积，mL；

V2——吸取出用于检测的提取溶液的体积，mL；

V3——加入异辛烷的体积(相当于定容体积)，mL；

m——试样的质量，g；

计算结果保留2位有效数字，当结果>1 mg/kg时保留3位有效数字。

2.7 实际样品测定与讨论 用上述建立的方法对11个面粉样品(市场购买)和10个小麦粒(取10个不同田块，田间采集无病害症状)样品进行了检测，其中市售的面粉中DON含量为<0.01～0.92mg/kg，污染率为90.9%，超标率为0。小麦粒中DON含量为0.53～3.32mg/kg，污染率为100%，超标率为50%。从检测结果可以看出，面粉中DON含量明显低于小麦粒中的DON含量，有可能是小麦粒经过市场进一步加工后，随着表面麦麸层的去除，在小麦籽粒中赤霉毒素DON也能进一步去除、减少。查询到文献，小麦经磨粉加工后，粗麸皮中DON含量达小麦籽粒的1.2～2.2倍，细麸皮中的毒素含量稍低于粗麸皮。因此从畜牧喂养安全来说，饲料的脱毒也是必要的一项措施。可以采取不同的方法进行脱毒处理如物理脱毒法、化学脱毒法、酶解法等[26-28]。

同时有文献[29]指出，乳酸菌对DON有清除作用，其作用机制是物理吸附，而非降解为其他代谢物。戊糖乳杆菌Lp23130、鼠李糖乳杆菌Lr23119和戊糖片球菌Pp23190对液体环境中DON的吸附率都达到了80%以上，脱毒效果明显。热处理及酸处理能够显著提高乳酸菌对DON的吸附能力。因此对小麦种子采取必要的脱毒处理，也是减轻赤霉病病害、提高小麦籽粒的商品品质，保证食品安全具有十分重要的意义。

DON既能引起人畜急性中毒也会造成慢性损害，所以加强对粮食中DON毒素的日常检测与监管是非常必要的，如监管中一旦发现小麦超标样品，则需尽快进行脱毒处理，再流入市场中。

3 结论

本文采用柱前衍生——气相色谱仪技术建立了分析小麦粉中脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒素含量的快速检测方法。样品经提取衍生化后无需净化，优化了样品前处理的时间。该方法简便、快速、准确、稳定、灵敏度高，普通适合于基层检测机构开展批量小麦粉(面粉)中DON含量的快速检测。本研究将为DON在小麦作物上的安全性评价提供检测依据,也为DON在其他农作物(农产品)中残留检测提供一定的参考价值。本研究检测结果同时也说明很多看似健康的小麦籽粒，很可能被毒素侵染，有些含量甚至超过1mg/kg的国家标准，所以为保证食品安全，人畜安全，从经济、安全角度考虑，如何对采收后的小麦粒进行毒素含量的日常监管和市售之前必要的脱毒处理值得思考！