右归饮调节神经细胞凋亡治疗轻微脑损伤的实验研究

王文珺邹阳,2黄杨

1.浙江中医药大学第二临床医学院 杭州 310053 2.浙江中医药大学附属第二医院 3.台州市立医院

轻微脑损伤是指脑部遭受到的轻度挫伤，在儿童时期多发，通常由高处坠落、体育运动、车祸伤等引起，发病率日益增加[1]。轻微脑损伤以神经细胞的变性和凋亡为主要特征[2]，虽然其严重程度轻于其他的闭合性神经损伤，但若早期发现和治疗不及时，仍会影响青少年的认知和平衡协调能力，对青少年的正常生长发育和社会生活造成影响[3]。轻微脑损伤给青少年患者带来的危害性不容忽视，所以迫切需要寻找更有效、副作用小的治疗方法。目前临床上针对轻微脑损伤的主要治疗手段是大量激素冲击和药物消肿，但存在诸多副作用[4]，总体治疗效果不佳。随着对中医药的研究进一步加深，发现中药治疗中枢神经损伤，可以促进神经生长因子释放、减少神经抑制因子的生成，且具有来源方便、毒副作用小、价格便宜等优势[5]。

中医理论认为，脑为髓之海，脑髓是神志活动的物质基础。大脑的轻微损伤引起的认知和运动协调能力下降，在中医学中属于“神志病”范畴，病因病机以肾阳亏虚为本，寒湿、痰瘀闭阻清窍为标。研究发现，右归饮作为补肾温阳的代表方，补肾益精健脑，可用于治疗神经损伤，保护肾虚模型大鼠损伤的神经细胞，升高大鼠大脑皮质抗凋亡蛋白/促凋亡蛋白比例（Bcl-2/Bax），减少神经细胞凋亡，促进神经轴突的再生[6]。因此本实验首次通过用右归饮治疗轻微脑损伤实验动物模型，观察其对神经细胞凋亡相关蛋白，以及血清炎性因子和神经血管生长因子表达的影响，明确右归饮的作用机制,为中医药治疗神经损伤提供更多的理论依据以及新的路径。

1 材料和方法

1.1 药品和试剂 右归饮由熟地黄9g、山茱萸3g、山药6g、制附子9g、肉桂3g、枸杞6g、姜杜仲6g和炙甘草3g组成[7]，将药物浓缩、干燥碾细后，得到右归饮细粉。以上药物购于浙江中医药大学名中医馆，方药制备于浙江中医药大学药学院中药制剂室。实验时将右归饮细粉用0.9%氯化钠溶液溶解至每毫升含生药0.69g备用。ELISA试剂盒购自江苏酶标生物科技有限公司（批号：20170601）；RNA提取试剂盒购自TaKaRa公司（批号：AK1401）；PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time）购自 TaKaRa公司（批号：AK5101）；SYBR Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)购自 TaKaRa公司（批号：AKA1201）；抗 caspase-3抗体购自北京博奥森公司（批号：AG04266808）；抗Bax抗体购自北京博奥森公司（批号：AG05085355）；抗Bcl-2抗体购自北京博奥森公司（批号：AG04279476）；抗细胞色素C（Cytochrome C，Cyt C）抗体购自北京博奥森公司（批号：AF07044415）；荧光羊抗兔抗体购自美国LI-COR公司（批号：C51104-08）；超敏酶标山羊抗兔抗体购自北京中杉生物技术公司（批号：107257D9）。

1.2 实验动物 清洁级SD大鼠 48只，雌雄各半，4周龄，实验初始体质量85～90g，购自中科院上海实验动物中心/上海斯莱克实验动物有限公司 [动物生产许可证号：SCXK(沪）2012-0002]。动物饲养和实验均在浙江中医药大学动物实验中心进行[动物使用许可证号：SYXK(浙）2013-0184]。

1.3 主要仪器 Nikon Eclipse 80i显微镜购自日本Nikon公司；Carl Zeiss Imaging Systems软件购自德国Carl Zeiss公司；HM335E切片机、AP280-2包埋机购自德国 MICROM公司；Mini Electrophoresis System电泳系统购自美国Bio-RAD公司；DRP-9052型电热恒温箱购自上海森信实验仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 动物造模与分组给药 将48只SD大鼠按随机数字表分为3组，每组16只，分别为空白对照组、模型组、右归饮治疗组。各组大鼠饲养条件相同，自由摄食和饮水。按照Mychasiuk等[8]提出的自由落体法造模：将右归饮治疗组、模型组大鼠置于麻醉机中，吸入浓度为1%～2%的异氟烷约3min。当大鼠足趾反射消失确认为轻度麻醉后，将大鼠从麻醉机中取出，俯卧位置于铝箔纸平台上，平台下方放置海绵垫保护。另将1枚150g的砝码通过尼龙线与铁架台固定后，置于1根直径2cm、长1.5m的柱状聚乙烯管中。将聚乙烯管置于大鼠头部上方，并用插销将砝码固定在大鼠头部中心上方0.5m处。将插销撤去后，砝码自由落下直接砸中锡箔纸平台上的大鼠头部正中央，大鼠跌落到海绵垫上，而尼龙线可将砝码固定在海绵垫上方，不至于继续下落产生二次伤害。该造模法持续3d，撞击1次/d。空白对照组大鼠不作任何处理。3d撞击结束后，经过行为学测试分析[1]，确定造模成功，分别对各组大鼠给药，经人-大鼠体表面积比值折算后[9]，右归饮治疗组以10g/kg的剂量行右归饮灌胃治疗，模型组和空白对照组大鼠同时予等体积的0.9%氯化钠溶液灌胃。均为1次/d，持续灌胃4周。

1.4.2 取材 灌胃4周后，所有大鼠均以2%戊巴比妥（0.3mL/100g）腹腔麻醉，心脏取血，离心分离血清后，-20℃保存。每组选择8只大鼠，取出大脑，予石蜡包埋后，行HE染色和免疫组化检测。每组余下8只大鼠处死后立即取出大脑，分离海马组织，于-80℃中保存，进行Western blot和QPCR检测。

1.4.3 观察指标

1.4.3.1 血清中细胞因子表达的检测 ELISA法检测大鼠血清中白细胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、血管内皮生长因子（vascular endothelia factor，VEGF）和神经生长因子（nerve growth factor，NGF）的表达量，具体操作按照试剂盒说明书进行。

1.4.3.2 HE染色观察海马组织病理学变化 大鼠脑组织石蜡包埋后，行冠状位5μm切片，烘干后以二甲苯脱蜡。切片经过乙醇和蒸馏水浸泡后，依次放入苏木精（Hematoxylin，H)和伊红（Eosin，E)染色液中进行HE染色，光学显微镜下观察海马组织病理学变化。

1.4.3.3 Western blot检测大鼠海马组织凋亡相关蛋白的表达 在海马组织标本中加入裂解液，4℃下裂解30min，BCA法计算样品蛋白浓度后，将裂解后的蛋白提取物上样于SDS聚丙烯酰胺凝胶上，电泳后转移到PVDF膜中。转膜结束后，将PVDF膜放入5%脱脂奶粉中封闭1h。封闭结束后，在4℃下分别加入caspase-3（1:100）、Bcl-2（1:100）、Bax（1:500）、Cyt C（1:100）一抗，孵育过夜。次日加入二抗（1:10000）在室温下继续孵育2h。二抗孵育完成后进行ECL曝光显影。并且用Image J软件对曝光显影后的条带扫描后进行灰度分析，计算出目的条带和内参条带的平均光密度值。

1.4.3.4 免疫组化检测大鼠海马组织凋亡相关蛋白的表达 将石蜡切片脱蜡、洗涤，经高压热修复后，在3%H2O2溶液中浸润10min，阻断过氧化物酶。取出切片，以PBS溶液反复洗涤3次。向切片中分别滴加caspase-3、Bcl-2、Bax、Cyt C 一抗（1:100），37℃孵育60min。PBS洗涤切片后向切片中滴加二抗（1:1），37℃中孵育60min，最后用DAB染色液进行显色，复染、透明后封片。用Nikon eclipse 80i显微镜200倍镜下观察，每张切片随机选取3个视野，利用Carl Zeiss Imaging Systems软件进行图像分析，计算出累积光密度（integrated opticdensity,IOD）和阳性指数，阳性指数为IOD与图像分辨率的比值。

1.4.3.5 QPCR检测大鼠海马组织中凋亡相关基因mRNA的表达 按照TaKaRa RNAiso Plus(Total RNA提取试剂）说明书提取大鼠海马组织总RNA，并且进行逆转录，条件如下：逆转录反应37℃ 15min，逆转录酶失活反应85℃ 5s，最终为4℃。引物由上海生工生物工程有限公司设计，见表1。操作按照TaKaRa荧光定量试剂盒SYBR Premix Ex TaqTMⅡ说明书进行，cDNA扩增条件如下：预变性 95℃ 3min；95℃ 10s，60℃ 30s，共 48 个循环；熔解曲线从 55℃开始，每30s升高0.5℃，直到95℃，1个循环。所有反应信息资料由StepOne Plus PCR仪收集，计算机软件测量并计算Ct值，mRNA相对表达量通过公式2-ΔΔCt计算。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析；方差分析后作两两比较的q检验，检验组间差异。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠血清炎性因子表达比较 与空白对照组比较，模型组大鼠血清中的炎性因子IL-1β、TNF-α、iNOS表达量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01），而VEGF和NGF的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。右归饮治疗组大鼠血清中 IL-1β、TNF-α、iNOS表达量明显低于模型组，但高于空白对照组；而VEGF和NGF的表达量则明显高于模型组和空白对照组，差异均有统计学意义（P＜0.01）。见表2。

2.2 各组大鼠海马组织中凋亡相关蛋白表达比较与空白对照组比较，模型组中凋亡蛋白caspase-3、Bax、Cyt C的表达量明显升高，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），而抗凋亡蛋白 Bcl-2 的表达差异无统计学意义（P＞0.05）。右归饮治疗组中凋亡蛋白caspase-3、Bax、Cyt C的表达量明显低于模型组，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），其中 Bax、Cyt C表达量高于空白对照组（P＜0.01）；而抗凋亡蛋白Bcl-2的表达量高于模型组和空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表3。

表2 各组大鼠血清 IL-1β、TNF-α、iNOS、VEGF 及 NGF 的含量比较（±s）Tab.2 Comparison of IL-1β,TNF-α,iNOS,VEGF and NGF of each group（±s）

表2 各组大鼠血清 IL-1β、TNF-α、iNOS、VEGF 及 NGF 的含量比较（±s）Tab.2 Comparison of IL-1β,TNF-α,iNOS,VEGF and NGF of each group（±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01。Note:Compared with blank control group,**P＜0.01;compared with model group,##P＜0.01.

组 别 n I L-1 β(p g·m L-1) T N F-α(p g·m L-1) i N O S(U·m L-1) V E G F(p g·m L-1) N G F(p g·m L-1)模型组右归饮治疗组空白对照组155.04±21.38247.03±19.43**##135.09±16.3716161625.56±3.02**20.85±1.42**##11.98±1.51209.44±28.38**169.85±11.46**##89.87±13.549.40±0.77**7.73±0.58**##5.15±0.66118.75±15.71184.16±19.81**##103.60±12.93

图1 各组大鼠海马组织中凋亡相关蛋白表达Fig.1 The expression of apoptosis related protein in hippocampus of each group

表3 各组大鼠海马组织中凋亡相关蛋白表达比较（±s）Tab.3 Comparison of the expression levels of apoptosis related protein in hippocampus of each group（±s）

表3 各组大鼠海马组织中凋亡相关蛋白表达比较（±s）Tab.3 Comparison of the expression levels of apoptosis related protein in hippocampus of each group（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with blank control group,*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05，##P＜0.01.

组别 n c a s p a s e-3/G A P D H B c l-2/G A P D H B a x/G A P D H C y t C/G A P D H模型组右归饮治疗组空白对照组0.50±0.02**0.41±0.03**#0.25±0.088 8 80.57±0.07**0.30±0.07##0.25±0.081.32±0.121.58±0.04*#1.32±0.201.73±0.05*1.53±0.05**#1.32±0.20

2.3 各组大鼠海马组织病理学变化 HE染色后镜下观察提示，空白对照组大鼠海马组织边缘清晰，细胞排列均匀，细胞外基质呈粉红色，细胞核为椭圆形，呈深蓝色。模型组大鼠海马中神经细胞排列紊乱，细胞数目稀少，细胞边缘模糊，伴有核碎裂。而右归饮治疗组中的海马组织边缘欠清晰，细胞排列尚均匀，细胞数量较模型组多。见图2。

图2 各组大鼠海马组织病理学变化（HE染色，20×）Fig.2 Pathological changes of HE staining in hippocampus of each group(HE stain,20×)

2.4 各组大鼠海马组织中的凋亡相关蛋白表达比较模型组中凋亡蛋白caspase-3、Bax和Cyt C表达阳性指数高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.01），而抗凋亡蛋白Bcl-2的阳性指数低于空白对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）；右归饮治疗组中caspase-3、Bax和Cyt C表达阳性指数低于模型组，高于空白对照组；Bcl-2的阳性指数高于模型组和空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）。见图3-6、表4。

图3 各组大鼠海马组织中Bax表达比较（20×）Fig.3 Expression of Bax protein in hippocampus tissues of each group(20×)

图4 各组大鼠海马组织中caspase-3表达比较（20×）Fig.4 Expression of caspase-3 protein in hippocampus tissues of each group(20×)

图5 各组大鼠海马组织中Cyt C表达比较（20×）Fig.5 Expression of Cyt C protein in hippocampus tissues of each group(20×)

图6 各组大鼠海马组织中Bcl-2表达比较（20×）Fig.6 Expression of Bcl-2 protein in hippocampus tissues of each group(20×)

表4 各组大鼠海马组织中凋亡相关蛋白表达的阳性指数（±s）Tab.4 Comparison of the expression levels of apoptotic related positive indexes in hippocampus tissues of each group（±s）

表4 各组大鼠海马组织中凋亡相关蛋白表达的阳性指数（±s）Tab.4 Comparison of the expression levels of apoptotic related positive indexes in hippocampus tissues of each group（±s）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with blank control group,**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05,##P＜0.01.

组别 n c a s p a s e-3 B c l-2 B a x C y t C模型组右归饮治疗组空白对照组0.02±0.00**0.01±0.00**##0.00±0.008 8 80.03±0.00**0.02±0.01**#0.01±0.000.02±0.010.19±0.03**##0.03±0.010.18±0.11**0.05±0.01#0.01±0.02

2.5 各组大鼠海马组织中凋亡相关基因mRNA表达比较 模型组中凋亡基因caspase-3、Bax和Cyt C mRNA相对表达量高于空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05），抗凋亡基因 Bcl-2 mRNA 相对表达量也高于空白对照组，但差异无统计学意义（P＞0.05）。右归饮治疗组中的凋亡基因caspase-3、Bax和Cyt C的mRNA相对表达量较模型组下调（P＜0.05，P＜0.01），而Cyt C mRNA相对表达量高于空白对照组（P＜0.01）；抗凋亡基因Bcl-2的mRNA相对表达量较其余两组上调，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表5。

表5 各组大鼠海马组织中凋亡相关基因mRNA的表达比较（±s）Tab.5 Comparison of the expression levels of apoptotic related gene in hippocampus tissues of each group（±s）

表5 各组大鼠海马组织中凋亡相关基因mRNA的表达比较（±s）Tab.5 Comparison of the expression levels of apoptotic related gene in hippocampus tissues of each group（±s）

注：与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。Note:Compared with blank control group,*P＜0.05，**P＜0.01;compared with model group,#P＜0.05，##P＜0.01.

组别 n c a s p a s e-3 B c l-2 B a x C y t C模型组右归饮治疗组空白对照组1.58±0.14**1.26±0.07**##0.96±0.138 8 81.48±0.28**1.05±0.20#1.00±0.081.26±0.251.85±0.52*#1.03±0.261.41±0.29*1.05±0.10#1.00±0.09

3 讨论

轻微脑损伤的严重程度较其他的闭合性神经损伤要轻，因此临床上容易忽视，而且目前西医缺乏有效的治疗手段，总体治疗效果欠佳。神经损伤的主要表现为神经细胞凋亡，即由某些体内外的因素触发和启动的细胞程序性死亡。在神经损伤和脑缺血的局灶中的研究发现[10-12]，炎性因子 IL-1β、TNF-α、iNOS 表达显著升高，激活小胶质细胞产生活性氧（reactive oxygen species，ROS），进一步加剧炎性反应[13-14]，同时促进死亡受体家族自杀相关因子（factor associated suicide，Fas）、自杀相关因子配体（factor associated suicide ligand，FasL）、肿瘤坏死因子受体 1（tumor necrosis factor receptor 1，TNFR1）基因的转录，并促进线粒体释放Cyt C等蛋白，激活caspase基因，上调与凋亡密切相关的水解酶caspase-3、caspase-9的活性[15-16]，从而诱导细胞凋亡。caspase-3是凋亡过程中最重要的蛋白酶，是多种死亡受体介导凋亡途径的共同下游部分和凋亡相关酶联反应的必经之路。而Bcl-2蛋白家族则是重要的凋亡调控因子，Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w可以抑制Cyt C从线粒体中释放，下调caspase-3的活性，抑制细胞凋亡；相反，Bax、Bak等蛋白则可促进Cyt C释放，促进凋亡[17-19]。因此抑制神经元的凋亡是治疗神经损伤的崭新思路。

轻微脑损伤在中医学中属于“神志病”范畴，因肾主志，生髓通脑，故治疗时宜强调温阳补肾、填精益髓。近年来在临床上通过使用人参、川芎、黄芪、当归等单味中药，以及补阳还五汤配合针灸疗法等治疗神经损伤，促进神经修复，取得了不错的治疗效果[20]。右归饮作为补肾温阳的代表方，方中附子和肉桂两药并用，培补肾中元阳、温里祛寒，是为君药；熟地黄、山茱萸、山药滋阴益肾、养肝补脾、填精益髓，取“阴中求阳”之义，是为臣药；杜仲补肝肾、强筋骨，为佐药。诸药合用，以温肾阳为主，而阴阳兼顾，肝脾肾并补。本实验发现，轻微脑损伤大鼠在右归饮治疗后，免疫组化、Western blot和QPCR检测的海马组织中 caspase-3、Cyt C、Bax等凋亡相关蛋白和mRNA的表达量较模型组明显下调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达上调，而右归饮治疗组大鼠血清中IL-1β、TNF-α、iNOS表达量显著降低，血管和神经生长因子VEGF、NGF表达量升高。结合前期研究结果[21]，说明右归饮用于轻微脑损伤大鼠的治疗，能够缓解大鼠体内炎性反应，减少线粒体中的Cyt C释放，从而抑制凋亡相关蛋白的表达，减轻神经细胞的损伤，并且增加VEGF、NGF等因子的释放，促进神经和血管的再生。与临床上针对轻微脑损伤的激素冲击、脱水消肿等常用治疗手段比较，右归饮可以有效促进神经再生、抑制神经凋亡、保护神经元存活，而且副反应较轻，还具有来源广泛、价格便宜等优势，患者可长期服用。

因此，根据中医“肾生髓通脑”理论，本研究首次发现，补肾中药右归饮在轻微脑损伤中可以发挥抗神经细胞凋亡的作用，降低炎症反应，下调凋亡相关蛋白的表达，从而保护神经。但是，调节神经细胞凋亡及神经修复和再生的机制十分复杂，补肾中药治疗神经损伤疾病的机制和效果仍需要更多的研究。