猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR方法的建立和应用

郝占武，张 志，张美晶，单 虎，李晓成*

(1.青岛农业大学，山东青岛 266109；2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032)

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)是20世纪80年代发现的一种无囊膜的单链环状DNA病毒，分为PCV1和PCV2两个亚型，PCV1感染后不引起任何临床症状，PCV2感染后则会引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(Post-weaning multisystemic wasting syndrome,PMWS)、皮炎性肾病、渐进性消瘦、呼吸道症状、黄疸、生长发育不良等多种症状[1-4]。自1998年中国首次发现PCV2以来，PCV2在我国猪群迅速蔓延开来，呈现出覆盖面广、感染率高的特征，已经成为严重危害我国猪群的主要病原之一[5-7]。2016年，美国学者Phan T G等[8]和Palinski R等[9]报道了一种新的猪圆环病毒亚型(PCV3)，携带该病原的猪呈现生长发育不良、心脏和多系统炎性浸润等病理变化，并在随后开展的流行病学调查中证实猪群中确实存在PCV3[8-9]。2017，我国学者Shen H等[10]也从发病的猪样品中检测到了PCV3，证明该病原也存在于我国猪群中。对PCV3这样一种新发现病原来说，建立一种快速、准确的检测方法是当务之急，但目前相关文献中PCV3的检测采用二代测序的方法[8]，该方法所需费用多，大大限制了其应用，因此，急需建立一种方便、敏感和特异的检测方法。本实验室在前期工作中已经建立了普通的PCR，在PCV3的流行病学调查和监测工作中发挥了重要作用(另文报道)，但普通PCR存在敏感性不足的问题，为此，本实验室在此基础上，结合SYBR Green Ⅰ技术，以最近公布的NCBI上的PCV3基因组序列为参考毒株，又建立了一种基于SYBR Green Ⅰ的实时荧光定量PCR检测方法，以期为后续的研究工作提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒和样品 经PCR检测和测序验证为PCV3阳性的样品，来自山东某发病猪场，用于构建阳性质粒的模板。采集23份猪样品，分别来自福建、山东、河南等省份的猪群腹泻样品或健康组织，用于PCV3临床应用检测。PCV1、PCV2、猪伪狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)、猪细小病毒(Porcine parvo virus，PPV),中国动物卫生流行病学中心畜病监测室分离鉴定和保存。

1.1.2 主要试剂 ExTaq、SYBR Premix ExTaq试剂盒，宝生物工程(大连)有限公司产品； DNAzol，Life公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计和合成 以NCBI上公布的我国PCV3全基因组序列(KY418606.1)为参考序列，利用DNA Star软件设计1对上、下游引物用于进行SYBR Green Ⅰ反应，上游引物为PCV3-F110：5′-GATGATGAAGCGGCCTCGTGTTTTGA-3′；下游引物为：PCV3-R284：5′-TCGGTCGGGGTCCAGTTGTTTATCGTA-3′；可以扩增175 bp的片段，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。

1.2.2 样品DNA的提取 根据DNAzol说明书，从猪样品和其他病毒液中提取总DNA，置-20℃保存备用。

1.2.3 阳性质粒的制备 以1.2.1设计的引物和中国动物卫生流行病学中心畜病监测室保存的PCV3阳性样品作为模板，进行PCR扩增和制备阳性质粒。

1.2.4 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的建立

1.2.4.1 SYBR Green Ⅰ real-time PCR反应体系的建立和反应条件优化 以PCV3阳性质粒作为模板的标准品进行实时荧光定量PCR反应，使用25 μL反应体系，SYBR Premix ExTaq混合物12.5 μL，上游引物和下游引物各 0.5 μL(10 μmol/L)，DNA 2 μL，用ddH2O 补充至25 μL。扩增条件为： 95℃预变性3 min；95℃10 s,60℃ 20 s,共40个循环；60℃读取荧光值，熔解曲线分析条件为95℃ 15 s，60℃ 20 s，95℃ 15 s。

1.2.4.2 SYBR Green Ⅰ real-time PCR标准曲线的建立 将已知浓度的PCV3阳性质粒分别进行10倍倍比稀释，取10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等不同的浓度作为模板进行实时荧光定量PCR扩增，将各浓度得到的Ct值为纵坐标，以稀释倍数的对数作为横坐标，制作标准曲线。

1.2.4.3 敏感性试验 将提取好的样品DNA模板用分光光度计检测DNA的含量，然后分别10倍倍比稀释，从109拷贝/μL稀释到101拷贝/μL，以各稀释度作为模板进行SYBR-Green Ⅰ荧光定量PCR分析，然后根据Ct值和线性关系系数确定最小检测限。

1.2.4.4 特异性试验 用已经建立好的方法，同时扩增猪圆环病毒PCV1、PCV2、PRV、PPV等提取的DNA模板，观察实时荧光定量PCR反应结果，评价本方法的特异性。

1.2.4.5 重复性试验 将已知浓度的PCV3阳性质粒模板分别稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，每个浓度分别用本方法重复检测3次，对检测结果进行统计学分析，评价本方法的重复性。

1.2.5 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的应用 采用建立的SYBR Green Ⅰreal-time PCR，对临床采集的23份猪样品进行检测，并将特异性条带进行测序和分子进化树分析，评价本方法的可行性。

2 结果

2.1 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的建立

将PCV3阳性质粒的浓度调整为5×1010拷贝/μL，然后将阳性质粒10倍倍比稀释，取浓度为10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9的稀释阳性质粒作为模板进行SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR扩增，发现随着模板拷贝数的降低，Ct值逐渐增加，10-2～-10-8等7个不同稀释度对应的荧光PCR的Ct值分别为 8.43、11.42、14.34、17.87、20.64、23.18、29.61，扩增曲线仍然为一条典型的“S”形扩增曲线，同时熔解曲线也清晰地显示该扩增曲线只有一个峰值，但当样品的稀释浓度为10-9时，荧光PCR则扩增不出典型的特异性曲线，这表明，样品的10-9倍稀释(浓度为50拷贝/μL)是本方法的检测极限(图1)。

A.样品;B.熔解曲线

A.Samples;B.Melting curves

图1 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的敏感性试验结果

Fig.1 Sensitivity test results of SYBR Green Ⅰ real-time PCR

2.2 SYBR Green Ⅰ real-time PCR标准曲线

用上述10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等不同浓度的阳性质粒稀释液作为模板进行real-time PCR扩增和制作标准曲线(图2)，从图2可以看出，不同浓度的样品稀释倍数与Ct值之间呈现较强的线性关系，根据荧光PCR仪自带的软件分析，可以得到相关的回归方程：y=2.998 3x+2.487 7，相关系数R2=0.998 1，表明该方法稳定性好，无论样品浓度高还是较低，其检测结果的误差都非常小，与理论值非常接近。

图2 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的标准曲线

2.3 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的特异性

用建立的SYBR Green Ⅰ real-time PCR对PCV1、PCV2、PRV、PPV等其他DNA病毒进行检测，结果表明，这些病毒均为阴性，没有扩增出特异性的条带，表明本方法对PCV3具有良好的特异性，对其他类似的DNA病毒无扩增交叉反应(图3)。

2.4 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的重复性

将PCV3阳性质粒的浓度调整为5×1010拷贝/μL，取阳性质粒DNA的10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等不同浓度的稀释液进行SYBR Green Ⅰ real-time PCR扩增，重复3次后进行统计分析，3次重复的变异系数(CV)均小于3%，表明本方法的重复性较好(表1)。

A.样品;B.熔解曲线

A.Samples;B.Melting curve

图3 SYBR Green Ⅰ real-time PCR特异性试验结果

注：“-”表示阴性。

Note："-"Means negative.

2.5 SYBR Green Ⅰ real-time PCR的初步应用

用建立的real-time PCR方法对23份临床采集的猪样品进行检测，结果有5份样品扩增出典型的S型曲线，熔解曲线也显示只有一个峰，且峰值与阳性样品的峰值一致(图4)。选择其中5个特异性条带进行测序和分子进化分析，这5份样品条带的核酸序列与PCV3参考毒株(KY418606.1)的同源性为97.2%～99%，表明这些扩增的条带都是PCV3特异性的，说明本方法用于实际生产中PCV3的流行病学调查和监测是可行的。

A.熔解曲线;B.临床样品

A.Melting curve;B.Clinical samples

图4临床样品SYBR Green Ⅰ real-time PCR检测结果

Fig.4 Detection result of clinical samples with PCV3 by SYBR Green Ⅰ real-time PCR

3 讨论

近年来，以SYBR Green Ⅰ染料法和TaqMan探针法为代表的实时荧光定量PCR发展极为迅速[11-12]。相比TaqMan探针法而言，SYBR Green Ⅰ染料法操作简便，其原理是作为不对称菁类荧光素的SYBR Green Ⅰ能与DNA小沟结合，而且二者一旦结合后,形成的荧光大大增强，随着PCR的进程荧光信号不断增加，从而形成特异性的“S”型扩增曲线，且荧光的强度与原始模板的浓度呈正相关，因此可以对靶核酸进行定量检测。SYBR Green Ⅰ染料法避免了探针引物的设计和标记，具有应用灵活、操作简单、敏感性高和特异性强的特点，它允许靶基因对应的引物上少量碱基发生变异而不影响扩增效果，同时结合样品熔解曲线有无峰和峰的位置可做出准确判断，因此在疫病病原的检测中广为使用。但有关PCV3的实时荧光定量PCR方法国内外均尚未见到相关报道，为此，本文基于SYBR Green Ⅰ首次建立了检测PCV3的real-time PCR方法，且在特异性试验、敏感性试验、重复性试验以及临床应用中都显示了较好的效果。

由于PCV3发现时间不长，对PCV3的核酸信息了解较少，因此，在初期采用SYBR Green Ⅰ染料法是一个比较适宜的方法，可用于PCV3感染的流行病学调查和检测，有助于早期发现PCV3的感染和流行，及时采取有效措施预防和控制。我们在前期设计引物时曾经设计了5对位置不同的引物(略)，同时用这5对引物进行了SYBR Green Ⅰ荧光PCR试验，经过比对后发现只有1对引物的特异性、敏感性和重复性较好，因此本文只列出了该对引物。尽管如此，从该试验中也可知，不同位置的引物建立的SYBR Green Ⅰ real-time PCR之间在PCV3的检测效果上存在较大差异，因此，在设计引物时一定要设计多对引物进行相关试验，从中筛选最佳引物，建立最佳的检测方法。

我国是世界第一养猪大国，每一种新的猪病发生和流行都会给养猪业带来巨大损失，必须引起人们的重视。及时准确地发现病原是预防和控制疫病流行的基础，相信本文建立的SYBR Green Ⅰ real-time PCR，一定会在PCV3的流行病学调查和监测工作中发挥重要作用。