新疆部分地区肉牛源沙门菌的分离鉴定与耐药性分析

阿热阿依·海依拉提，彭 斌，张晓玲，姚 刚，克然木·托乎提，冷朝升,雷程红*

(1.新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.库尔勒市动物卫生监督所，新疆库尔勒 841000)

沙门菌(Salmonella)是一群存在于人和动物肠道内的革兰阴性杆菌，是一种重要的人兽共患病病原，在医学、兽医学和公共卫生上均十分重要[1]。畜禽感染沙门菌主要表现为发热、胃肠炎、腹泻、败血症及母畜流产等[2]。沙门菌在动物与动物、动物与人、人与人之间通过消化道间接或直接传播[3]。目前由沙门菌引起的食源性疾病已成为世界范围内重要的公共卫生问题。在细菌性食物中毒中，由沙门菌引起的食物中毒病例居于首位[4]。在引起沙门菌中毒的食品中，约90%是肉、蛋、奶等畜禽产品，鸡肉、羊肉、牛肉等已被认为是人感染沙门菌的主要来源。畜禽感染沙门菌也常会表现为无症状带菌，会降低动物的生产繁殖能力，或者可能加重病态或增加死亡率，呈现出有临床症状的致死性疾病，造成经济损失，对畜牧业的健康发展和人类健康构成潜在威胁[5]。许多调查发现由于养殖业长期不合理使用抗菌药物，导致沙门菌的耐药性增强和耐药谱增宽，使得沙门菌感染的治疗难度增加，同时可能使耐药菌株从农场流向餐桌，使人类感染耐药沙门菌株，最终导致使用抗菌药物治疗失败[6]。目前，沙门菌对早期用于该菌治疗的青霉素、四环素、氯霉素及磺胺类等药物的耐药性增长十分严重[7]。肉牛养殖是新疆畜牧业的重要组成部分，肉牛健康养殖对于保障牛肉的卫生质量具有重要意义。目前在新疆地区表观健康肉牛沙门菌带菌情况及分离株耐药性尚缺乏相关数据。因此，本研究对新疆地区表观健康肉牛携带的沙门菌进行了分离鉴定，并对沙门菌分离株的耐药性进行了检测分析，旨在为肉牛的健康养殖及临床合理使用抗菌药物提供科学依据，为预防和控制人感染沙门菌提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验用动物及参考菌株 新疆库尔勒市周边某肉牛养殖场各个生长阶段的肉牛753头。阳性对照菌株为鼠伤寒沙门菌ATCC13311,新疆农业大学动物性食品卫生学实验室保存；阴性对照菌株为大肠埃希菌ATCC25922，杭州天和微生物试剂有限公司产品。

1.1.2 主要仪器 电热恒温培养箱，上海一恒科学仪器有限公司产品；立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂产品；电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司产品；PCR 仪、高速离心机、移液器，德国Eppendorf 公司产品；凝胶成像仪，美国伯乐公司产品；水平电泳槽、电泳仪，北京六一仪器厂产品；超净工作台，上海博讯有限公司产品。

1.1.3 主要试剂 蛋白胨缓冲液(buffered peptone water，BPW)、四硫磺酸钠煌绿增菌液(tetrathionate broth base，TTB)、亚硒酸盐胱氨酸增菌液(selenite cystine broth，SC)、木糖赖氨酸脱氧胆盐琼脂培养基(xylose lysine desoxycholate，XLD)、亚硫酸铋培养基(bismuth sulfite，BS)、沙门菌显色培养基，青岛日水生物技术有限公司产品；沙门菌生化鉴定套盒，北京陆桥技术有限责任公司产品；PCR反应试剂、DNA标准DL 1 000，北京天根生化试剂公司产品；甲氧苄啶(含量98%)、氯霉素(含量98%)、氟苯尼考(含量98%)、链霉素(含量77.4%)、氨苄西林(含量86.5%)、诺氟沙星(含量98%)、环丙沙星(含量98%)，北京索莱宝生物公司产品；四环素(含量95%)、磺胺异恶唑(含量98%)、阿莫西林(含量98%)，中国食品药品检定研究院产品。

1.2 方法

1.2.1 样品采集与处理 2017年4月在新疆库尔勒市周边某肉牛场采集表观健康肉牛的肛拭子样品753份，将采集的肛拭子样品置于无菌Cary-Blair氏运送培养基内冷藏，8 h内运回实验室。

1.2.2 沙门菌的分离纯化 在无菌条件下，将运送培养基中的肛拭子移置至加有灭菌的1.5 mL BPW前增菌液的离心管中，在37℃振荡培养箱培养18 h；后各取1 mL BPW转种于10 mL TTB增菌液和SC增菌液中并混匀，然后分别在42℃±1℃和36℃±1℃条件下培养18 h～24 h。培养结束的增菌液同时划线接种于XLD、BS选择性培养基上和沙门菌显色培养基上，然后在37℃条件下分别培养18 h～24 h和40 h～48 h进行培养，培养结束后观察各平板上有无典型或可疑沙门菌。同时采用沙门菌参考菌株和大肠埃希菌参考菌株作对照。

1.2.3 沙门菌的生化鉴定 参考食品安全国家标准GB4789.4-2016《食品微生物学检验沙门菌检验》[8]中的方法，用沙门菌生化鉴定试剂盒进行生化鉴定。

1.2.4 沙门菌分离株PCR鉴定

1.2.4.1 引物 根据文献[9]针对沙门菌invA基因(表1)，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成(表1)。

表1 靶基因名称及引物序列

1.2.4.2 分离株DNA的提取 向已灭菌的2 mL EP管中加入2 000 μL菌液，以13 000 r/min离心10 min后弃去上清液，向其中加入100 mL TE buffer涡旋振荡30 s，后置于100℃水浴煮沸10 min，取出立即置于冰盒内冰浴10 min，再以12 000 r/min离心2 min，取上清液保存于-20℃备用。

1.2.4.3 invA基因PCR扩增 根据文献和预试验结果，PCR反应体系包括：Mix 10 μL，invA基因上、下引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，补ddH2O至终体积为25 μL。PCR反应程序：94℃ 5 min；94℃ 30 s，58.5℃ 30 s，共35个循环；72℃ 50 s,72℃ 5 min，置4℃保存。

1.2.4.4 PCR产物电泳检测 将产物于10 g/L琼脂糖凝胶电泳后，胶成像系统分析结果，能扩增出大小为284 bp的invA基因特异性片段的菌株为沙门菌阳性菌株。

1.2.5 药敏试验 采用美国临床实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推荐的微量肉汤稀释法，测定最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)，进行10种临床常见抗菌药物耐药性试验，并分析沙门菌分离株的耐药情况。

根据CLSI(2016)标准对药敏结果进行判读，统计出沙门菌分离菌株的耐药菌株数，计算出对各种抗菌药的耐药率。

耐药率=(对该抗菌药物耐药的菌株数目/菌株总数)×100%

2 结果

2.1 疑似沙门菌分离结果

753份样品通过选择性增菌液、选择性培养基及显色培养基筛选得到疑似沙门菌分离株90株。部分疑似沙门菌分离株在XLD培养基和BS培养基上的菌落形态分别见图1和图2。

2.2 疑似沙门菌PCR鉴定结果

采用参考菌株和空白试验对所设计的2对引物进行PCR特异性验证，结果表明，鼠伤寒沙门菌ATCC13311扩增出目的片段，其余对照均未扩增出任何目的片段，说明所设计的引物特异性可靠(图 3 )。

图1 沙门菌在XLD培养基上菌落形态

图2 沙门菌在BS培养基上菌落形态

M.DNA标准DL 1 000;+.阳性对照；-.阴性对照；1～6.部分疑似沙门菌菌株

M.DNA Marker DL 1 000;+.Positive control; -.Negative control;1-6.Some suspectedSalmonellastrains

图3疑似沙门菌PCR扩增产物

Fig.3 PCR amplified products from suspectedSalmonella

2.3 表观健康肉牛沙门菌带菌检测结果

753份样品经选择性增菌液、选择性培养基、显色培养基、革兰染色、生化鉴定及PCR鉴定后，最终确定得到63株沙门菌分离株，每株沙门菌均来自不同的样品，故表观健康肉牛沙门菌带菌率为8.37%(63/753)(表2)。

表2 表观健康肉牛沙门菌带菌率

2.4 牛源沙门菌分离株耐药性

63株沙门菌分离株对10种药物的耐药程度明显不同，63株沙门菌对甲氧苄啶的耐药率最高，达97.2%；其次为氯霉素，耐药率为94.7%；对四环素的耐药率为74.7%；对磺胺异恶唑和链霉素的耐药率分别为61.5%和54.2%；对氨苄西林、阿莫西林的耐药率则分别为29.9%和45.5%；其余3种药物诺氟沙星、环丙沙星和氟苯尼考的耐药率相对较低，分别为16.6%、14%和11.3%(表3)。整体耐药率比较情况见图4。

表3 沙门菌耐药率结果

图4 沙门菌耐药率比较

63株沙门菌中未出现全敏感性菌株，有4株可抗2种抗菌药物(6.35%)，有13株可抗3种抗菌药物，所占耐药比重最大为20.63%，可抗4种抗菌药物与5种抗菌药物的菌株数均为11株(17.46%)，抗6种及以上的菌株数达24株(38.09%)。63株沙门菌产生了34种耐药谱，耐药谱型复杂，主导耐药谱为以下3种，分别为TE-TMP-C、SIZ-S-TE-TMP-C、SIZ-S-AM-AMX-TE-TMP-C。耐药种数与耐药菌株数见表4。

表4 多重耐药与耐药菌株数

3 讨论

在养殖过程中肉牛隐性携带沙门菌会通过排泄物、分泌物持续向环境中排放沙门菌导致环境污染和其他动物的感染，在屠宰、分割、运输及储存环节也会增加牛肉受沙门菌污染的风险。目前国内鸡源、猪源沙门菌已有较多研究报道，但有关表观健康肉牛携带沙门菌研究的报道较少。朱晓霞[10]研究发现，四川广汉屠宰场体征健康待宰牦牛沙门菌携带率为50%(13/26)。吴美云[11]对内蒙古地区健康奶牛直肠粪样进行沙门菌的分离鉴定，检出率为10.9%(38/350)。匡秀华[12]对湖北省、湖南省及河南省健康奶牛沙门菌进行了分离鉴定，分离率25.12%(105/428)。Perez-Montao J A等[13]的研究结果显示，墨西哥哈里斯科州牛源沙门菌污染率为15.4%。本试验结果显示，新疆库尔勒市规模化肉牛养殖场表观健康肉牛沙门菌带菌率为8.37%(63/753)，其带菌率低于上述研究报道的结果，说明该肉牛场沙门菌带菌率控制在相对较好的水平，但依然存在一定程度的污染，所以为降低牛场沙门菌的感染率及屠宰、分割、运输及储存环节牛肉被沙门菌污染的风险，仍然需要加强肉牛场健康牛携带沙门菌的监测及养殖场的卫生和生物安全措施。

近年来，世界各地报道的沙门菌耐药问题越来越严重。在畜牧兽医领域使用的抗菌药物种类多、数量大，在食用动物生产中的使用量远远高于人用量，造成沙门菌等细菌的耐药状况十分严重，严重威胁人类及动物疾病的治疗[14]，已成为全球关注的公共卫生问题。世界动物卫生组织(WHO)的报道显示，中国已成为目前世界上抗菌药物滥用最严重的国家之一，细菌耐药性逐渐普遍增强。耐药菌株可以直接或间接感染人，也增加了将相同的耐药性通过食物链传递给人体病原菌的风险[15]。尹明远[16]对乌鲁木齐肉源沙门菌对13种抗菌药物耐药的研究结果显示，99株沙门菌对甲氧苄啶(100%)、氯霉素(88.9%)、四环素(63.6%)、磺胺异恶唑(57.6%) 4种抗菌药物的耐药率均在50%以上，84.8%的菌株三重耐药。赵俊丽等[17]研究了内蒙古奶牛源沙门菌对22种抗菌药物耐药性，结果38株沙门菌对甲氧苄啶、磺胺异恶唑和氯霉素耐药率分别高达97.4%、94.7%和80%，76.3%的菌株对10种及10种以上抗菌药物耐药。葛琨等[18]对30株牛、羊肉源沙门菌耐药性研究的结果显示，分离株对甲氧苄啶、氯霉素和四环素的耐药率分别为100.0%、86.7%和60.0%。综上所述，沙门菌的耐药状况相当严重，多地区沙门菌对甲氧苄啶、氯霉素、四环素及磺胺异恶唑高度耐药。原因可能是这些药物在畜禽疾病治疗中使用时间长，使用量和使用频率较大，沙门菌在药物的选择压力作用下导致耐药性逐渐增高。为降低沙门菌耐药菌株对健康养殖和人类健康带来的安全问题，相关职能机构应该加强养殖环节抗菌药物规范使用的监管，合理选择药物，精确控制用药剂量，加强沙门菌的耐药性监测，积极应对细菌耐药性这一全球性公共卫生问题。