猪瘟病毒感染细胞中分子伴侣Jiv基因的表达检测与分析

谭学超，郭抗抗，刘发志，李海敏，姜 汹，蔡双双

(1.湖北三峡职业技术学院，湖北宜昌 443000；2.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

近年来，在猪瘟(Classical swine fever,CSF)的防控中由于隐性感染和长期带毒等非典型临床症状的大量出现，给本病的诊断、防控带来了极大干扰，严重制约养猪业的发展。研究猪瘟病毒(Classical swine fever virus，CSFV)致病机理是探寻新的有效防控方法的基础。Jiv(J-domain protein interacting with virus,Jiv)是一类与瘟病毒致病性密切相关的细胞分子伴侣，属于热休克蛋白Dna J家族成员。研究发现，Jiv基因在牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)的致细胞病变作用(cytopathic effect,CPE)中必不可少[1]，Jiv基因表达产物能诱导BVDV的NS2-3聚蛋白的切割而产生NS2和NS3蛋白单体，通过NS3蛋白促使BVDV产生CPE，同时调节病毒在感染细胞内的RNA复制[2]。CSFV和BVDV同属于瘟病毒属成员，在基因组结构、致病机制上有诸多相似性，所以推测Jiv蛋白在CSFV感染和致病中也可能发挥着重要作用。Gallei A等[3]将Jiv基因与CSFV Alfort-p447毒株基因组整合构建了重组病毒Alfort-Jiv，感染SK-6细胞后发现大量NS3蛋白得出现，并在感染细胞中出现CPE，重组病毒在核酸水平的复制较亲本病毒Alfort-p447毒株更高。研究表明,Jiv基因插入CSFV基因组中并表达，在CSFV感染和复制过程中发挥作用。但其参与CSFV致病作用和RNA复制的机制尚不清楚，有待进一步研究。

本试验以Jiv为研究对象，通过实时荧光定量PCR对3种猪源细胞感染CSFV后Jiv和病毒基因表达进行检测，分析二者之间的相关性，探究细胞Jiv基因在CSFV感染细胞中表达规律，为进一步明确Jiv蛋白参与CSFV复制的机制提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株和病毒 猪脐静脉血管内皮细胞(SUVEC)、猪肾细胞(PK-15)、猪睾丸细胞(ST)，西北农林科技大学重大畜禽疫病防治与畜产品安全实验室提供；CSFV石门株，购自中国兽医药品监察所。

1.1.2 主要试剂 SYBR GreenⅠPremix试剂、PCR试剂、DL 2 000 Marker、pMD19-T simple vector、DNA回收试剂盒、一步法反转录试剂盒等，宝生物工程(大连)有限公司产品；质粒提取试剂盒，天根生物工程公司产品；胎牛血清和DMEM培养基，Gibco公司产品；Trizol裂解液，英潍捷基(上海)贸易有限公司Invitrigen产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参照文献[4]所建立的实时荧光定量PCR方法扩增Jiv基因和β-actin内参基因。扩增猪Jiv基因的上游引物(Jiv-F)：5′-GTCAGGCAGATAAGCGTAGA-3′,下游引物(Jiv-R)：5′-CCACTAATACCAGCAGTTCG-3′，产物的长度为109 bp。扩增猪β-actin基因的引物序列为：5′-CAAGGACCTCTACGCCAACAC-3′(β-actin-F)，5′-TGGAGGCGCGATGATCTT-3′(β-actin-R)，产物的长度为125 bp。引物由英潍捷基(上海)贸易有限公司Invitrogen合成，使用浓度均为10 μmol/L。

1.2.2 细胞接毒 用6孔细胞培养板培养ST、PK-15、SUVEC细胞，待细胞的汇合度达到60%～80%时，弃去培养液，每孔接种CSFV石门株200 μL(MOI=1)，补加DMEM培养液(含20 mL/L FBS)至1 mL，37℃下孵育2 h后吸出病毒液，换DMEM培养液(含20 mL/L FBS)，置细胞培养箱中进行培养。分别于0、24、48、72、96 h后用2.5 mg/mL胰酶消化制成细胞悬液备用。

1.2.3 细胞总RNA的提取和cDNA合成 用Trizol法对1.2.2获得的3种细胞系在CSFV感染后不同时间收集的样品提取RNA，cDNA反转录以Oligo随机引物进行，按照反转录试剂盒使用说明书进行操作。

1.2.4 Jiv和CSFV基因的检测 以获得的3种细胞系感染CSFV后不同时间的cDNA为模板，参照文献[4]所建立的实时荧光定量PCR对Jiv和β-actin内参基因进行实时扩增，参照文献[5]建立的猪瘟病毒实时荧光定量PCR对CSFV的5′-UTR基因进行扩增，最终结果均引入内参基因β-actin进行校正，以2-△△Ct值表示。

2 结果

2.1 SUVEC细胞Jiv和CSFV基因检测结果

通过实时荧光定量PCR检测SUVEC细胞在CSFV感染后不同时间的Jiv和CSFV基因表达，结果显示，在0～72 h，二者均随感染时间逐步上升， 96 h时有所下降，变化趋势基本一致(图1)；在0～48 h，Jiv基因mRNA表达上升幅度显著高于其他时间段。

2.2 PK-15细胞Jiv和CSFV基因检测结果

对PK-15细胞Jiv和CSFV基因表达进行实时荧光定量PCR检测，结果显示，PK-15细胞中Jiv和CSFV基因表达在各感染时间也呈正相关现象，变化趋势与SUVEC细胞基本一致(图2)。

A.Jiv的mRNA;B.CSFV的RNA

A.Jiv mRNA;B.CSFV RNA

图1 SUVEC细胞Jiv和CSFV基因检测结果

Fig.1 The results of Jiv and CSFV genes expression in SUVEC cells

2.3 ST细胞Jiv和CSFV基因检测结果

对ST细胞Jiv和CSFV基因在各感染时间段进行检测，显示二者的变化趋势与上述两种细胞基本一致，ST细胞在各感染时间的Jiv和CSFV的基因表达水平均高于其他两种细胞(图3)。

从上述结果可以看出，SUVEC、PK-15和ST细胞中均存在的Jiv基因的表达，其中ST细胞的表达水平最高，分别为SUVEC和PK-15细胞的3.8倍和2.1倍，表明细胞本身表达Jiv蛋白，不同细胞类型间存在表达差异。比较3种细胞中CSFV基因的表达，发现ST细胞也显著高于其他两种细胞，说明细胞Jiv蛋白表达可能影响CSFV的RNA复制，提示Jiv蛋白在CSFV复制中可能发挥一定的调节作用。细胞感染CSFV后，在各感染时间Jiv基因在mRNA水平较未感染细胞均有显著增高，其中0～48 h的增幅均高于其他时间，表明CSFV感染能促进细胞Jiv基因的表达，在感染早期这种作用较为明显。此外，Jiv基因在核酸水平的表达变化和CSFV基本一致，呈正相关限项，表明Jiv基因表达与CSFV核酸复制存在联系。

A.Jiv的mRNA;B.CSFV的RNA

A.Jiv mRNA;B.CSFV RNA

图2 PK-15细胞Jiv和CSFV基因检测结果

Fig.2 The results of Jiv and CSFV genes expression in PK-15 cells

A.Jiv的mRNA;B.CSFV的RNA

A.Jiv mRNA;B.CSFV RNA

图3 ST细胞Jiv和CSFV基因检测结果

Fig.3 The results of Jiv and CSFV genes expression in ST cells

3 讨论

猪瘟病毒免疫耐受和免疫失败现象时有发生，CSFV持续性感染机制的阐明是研究有针对性措施的基础。CSFV在宿主体内的感染和致病过程需要宿主调节因子和病毒蛋白的相互作用才能完成，宿主蛋白在CSFV致病中也发挥着重要的作用[6]。目前，CSFV自身蛋白的作用研究已较深入，而宿主蛋白参与CSFV的调节机制尚不清晰，Jiv蛋白与CSFV相互作用关系的发现，可能为进一步阐明CSFV致病机理提供新的突破口。研究表明，Jiv蛋白的表达对CSFV的感染性和致病性都有明显的作用[3]，但Jiv蛋白与CSFV作用机制还有待研究。因此，检测分析宿主细胞内Jiv基因在感染CSFV不同时间的表达规律，对Jiv与CSFV在感染过程中的基因表达进行相关性分析，可对进一步明确Jiv参与CSFV致病机制研究提供参考资料。

本研究所用的Jiv基因实时荧光定量PCR是笔者通过试验优化后的方法，对其特异性、敏感性、准确性和重复性均进行了试验论证，因此，最终获得的结果具有较高的可信度。

在对猪瘟病毒感染的3种猪源细胞(ST、PK、SUVEC)在感染不同时间的Jiv和CSFV基因表达进行检测的过程中，分别对3种细胞在CSFV不同感染时间采集样品作为平行试验组，参照不同细胞的检测结果使得数据更加可靠。结果显示，在CSFV不同感染时间，Jiv和CSFV的基因表达在各猪源细胞株中均呈现出类似的现象，呈正相关趋势，说明细胞Jiv基因表达与CSFV核酸复制存在密切联系，而二者之间是否存在相互作用，目前尚不能得出结论，还需进一步研究。Jiv的mRNA在0～48 h的增幅高于其他时间段，推测Jiv蛋白参与CSFV核酸复制可能主要发生在病毒感染早期。此外，ST细胞中Jiv基因mRNA表达和CSFV核酸复制在各感染时间均高于其他两种细胞，提示Jiv基因在不同细胞内的表达差异可能影响CSFV的复制，这一发现与Guo K K等[7]研究Jiv基因在不同猪源组织的表达差异与CSFV组织嗜性的关系所获得结果具有极高的相似性，据此推测CSFV在感染机体时选择增殖靶组织的原因可能与Jiv在细胞内的表达差异有关。

基于上述结果，推测细胞Jiv基因的表达可能与CSFV复制有着密切的关系，但其作用机制还有待进一步深入研究和阐明。